本发明专利技术涉及用于鉴定特异性免疫细胞(特别是初始CD8+ T细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析哺乳动物内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与非初始CD8+ T细胞或任何其它(血液)细胞类型相比时，所述基因区的脱甲基化或甲基化的缺乏指示初始CD8+ T细胞。根据本发明专利技术的分析可以在表观遗传水平上鉴定初始CD8+ T细胞，并将它们与复杂样品中的所有其它细胞(如例如其它血液细胞或免疫细胞)区分开。本发明专利技术还提供了用于定量初始CD8+ T细胞(特别是在初始CD8+ T细胞复杂样品中的初始CD8+ T细胞)的改进方法。所述方法可以在有或没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行。
Endothelial sialic acid protein (cd248) as an epigenetic marker for the identification of immune cells, especially initial CD8 + T cells
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为用于鉴定免疫细胞，特别是初始CD8+T细胞的表观遗传标志物的内皮唾液酸蛋白(CD248)本专利技术涉及用于鉴定特异性免疫细胞(特别是初始CD8+T细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析哺乳动物内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰(如甲基化状态)，其中当与非初始CD8+T细胞或任何其它(血液)细胞类型相比时，所述基因区的脱甲基化或修饰(如甲基化)的缺乏指示初始CD8+T细胞。根据本专利技术的分析可以在表观遗传水平上鉴定初始CD8+T细胞，并将它们与复杂样品中的所有其它细胞(如例如其它血液细胞或免疫细胞)区分开。本专利技术还提供了用于定量初始CD8+T细胞(特别是在初始CD8+T细胞复杂样品中的初始CD8+T细胞)的改进方法。所述方法可以在有或没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下进行，优选在全血和/或非胰蛋白酶消化的组织中进行。此外，本专利技术涉及用于进行上述方法的试剂盒及其各自的用途。本专利技术的一个目的是提供一种新颖的，更稳健的方法来定量检测和测量任何体液(如血液)、任何实体器官或组织内的或哺乳动物的初始CD8+T细胞。专利技术背景初始CD8+T细胞是在骨髓中已分化的并且成功地经历了胸腺中中枢选择的阳性和阴性过程的T细胞，并且构成初始形式的细胞毒性T细胞(CD8+)。初始T细胞被认为是成熟的，并且与激活的或记忆性T细胞不同，没有遇到它在外周内的同源抗原。通常初始T细胞的特征为：以L-选择素(CD62L)的表面表达；不存在激活标志物CD25、CD44或CD69；并且不存在记忆性CD45RO同种型。它们也被描述为表达功能性IL-7受体，其由亚基IL-7受体α、CD127和共同γ链、CD132组成。即使个体中几乎所有细胞都含有完全相同的DNA编码互补序列，高等生物体也必须在不同类型的组织中强加和维持不同模式的基因表达。大多数基因调控是暂时的，这取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持续调控是表观遗传学-可遗传调控模式的主要作用，所述表观遗传学-可遗传调控模式不改变DNA的基本遗传编码。DNA甲基化是表观遗传调控的典型形式；它用作细胞的稳定存储器，并在维持各种单元类型的长期身份方面发挥关键作用。最近，发现了其它形式的表观遗传调控。除了“第五个碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)之外，还可以发现第六个(5-羟甲基胞嘧啶，hmc)、第七个(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八个(5-羧基胞嘧啶，cC)(MichaelJ.Booth等人，QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience，2012年5月18日，Vol.336no.6083pp.934-937)。所述DNA修饰的主要靶标是两核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(‘CpG位点’)；在本文中，胞嘧啶(C)可以进行简单的化学修饰以变成甲酰化的、甲基化的、羟甲基化的或羧基化的。在人类基因组中，CG序列比预期的稀少得多，除了在被称为“CpG岛”的某些相对密集的簇中。CpG岛经常与基因启动子相关，并且据估计超过一半的人基因具有CpG岛(Antequera和Bird,ProcNatlAcadSciUSA90:11995-9,1993)。DNA的异常甲基化经常与从健康细胞到癌细胞的转化有关。在所观察到的效果中包括基因组范围的低甲基化、肿瘤抑制基因的增加的甲基化和许多致癌基因的低甲基化(例如，Jones和Laird综述，NatureGenetics21:163-167,1999；Esteller,Oncogene21:5427-5440，2002；和Laird,NatureReviews/Cancer3:253-266，2003)。已经认识到甲基化谱是肿瘤特异性的(即，特定基因或甚至单个CpG的甲基化模式的改变是特定肿瘤类型的诊断)，并且现在存在对膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌的诊断标志物的广泛收集(例如，由Laird,NatureReviews/Cancer3:253-266，2003概述的)。对于最近所描述的胞嘧啶的修饰之一(5-羟甲基化)显示了氧化性亚硫酸氢盐测序在CpG岛上作图和定量5hmC的效用(MichaelJ.Booth等人，QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience，2012年5月18日，Vol.336no.6083pp.934-937)。在与转录调节子相关的CpG岛中和在长散在的核元件中发现高水平的5hmC。提示这些区域可能在胚胎干细胞中经历表观遗传重编程。可以在两步程序中进行初始CD8+T细胞的分离。首先，通过耗尽用生物素缀合的抗体和抗生物素微珠的混合物间接磁性标记的非初始T细胞和NK细胞富集初始T细胞。在第二步中，用CD8微珠标记富集的初始T细胞，用于随后CD8+初始T细胞的阳性选择。WO98/10284描述了捕获、纯化和扩增抗原特异性T淋巴细胞的方法。WO2006/060719公开了使用抗体、衍生物和片段检测和分离内皮唾液酸蛋白阳性细胞的方法。WO2012/162660描述了使用DNA甲基化阵列的方法，其被提供用于鉴定细胞或细胞混合物以及用于定量血液或组织中的细胞分布的改变，以及用于诊断、预测和治疗疾病病况，特别是癌症。该方法使用新鲜的和存档的样品。WO2013/014122涉及用于鉴定通常表达表面蛋白CD56和/或CD16的哺乳动物中的自然杀伤细胞及它们的亚组(优选为CD3阴性、非T淋巴细胞源的NK细胞)的方法(特别是体外方法)，其包括分析OSBPL(如OSBPL5)的基因组DNA对亚硫酸氢盐转化的可及性和/或OSBPL(如OSBPL5)的基因中至少一个CpG位置的甲基化状态。Suarez-等人(PhenotypiccharacteristicsofagedCD4+CD28nullTlymphocytesaredeterminedbychangesinthewhole-genomeDNAmethylationpattern.AgingCell.2017Apr；16(2):293-303.Epub2016Dec27)分析CD28无(CD28null)T细胞及其CD28+对应物的全基因组DNA甲基化和基因表达谱。比较分析揭示296个基因在两个细胞亚群之间差异甲基化。HardieD.L.等人(在：ThestromalcellantigenCD248(endosialin)isexpressedonnaiveCD8+humanTcellsandregulatesproliferation.Immunology133,288–295(2011))公开了CD248由人而不是小鼠(C57BL/6)的CD8+初始T细胞唯一地表达。它们的数据证明CD248对造血(CD8+)细胞与基质细胞的功能相反，并提示CD248有助于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴定来源于人的样品中初始CD8+T细胞的方法，其包括分析人内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰，诸如例如甲基化状态，其中优选地，所分析的所述基因区根据SEQ ID No.1定位，其中当与非初始CD8+T细胞相比时，所述基因区的所述修饰的缺乏，诸如脱甲基化或甲基化的缺乏指示初始CD8+T细胞。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171026 DE 102017125150.21.用于鉴定来源于人的样品中初始CD8+T细胞的方法，其包括分析人内皮唾液酸蛋白(CD248)基因区中至少一个CpG位置的修饰，诸如例如甲基化状态，其中优选地，所分析的所述基因区根据SEQIDNo.1定位，其中当与非初始CD8+T细胞相比时，所述基因区的所述修饰的缺乏，诸如脱甲基化或甲基化的缺乏指示初始CD8+T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CpG位置存在于所分析的所述基因区的转录起始上游的5’区、启动子区、5’或3’非翻译区、外显子、内含子、外显子/内含子边界，和/或转录终止下游的3’区。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个CpG位置选自这样的CpG，其选自根据SEQIDNo.1的扩增子中的CpG的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21，并且优选地选自根据根据SEQIDNo.2或3的亚硫酸氢盐转化序列的第1817号扩增子的片段中的CpG位置10、11、12和13。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐可转化性的分析包括选自甲基化特异性酶促消化、亚硫酸氢盐测序的方法，选自启动子甲基化、CpG岛甲基化、MSP、重甲基、甲基化荧光检测、Ms-SNuPE的分析，以及依赖于扩增DNA的检测的其它方法。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括基于比较所分析的区域中所述甲基化频率的相对量与诸如例如GAPDH的对照基因中的甲基化频率的相对量，对初始CD8+T细胞的相对量进行定量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品选自哺乳动物体液，其包括人血液样品，或组织、器官或细胞类型的血液样品，血液淋巴细胞样品或其级分。
<...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯文·欧莱克，贾尼卡·约瑟芬·舒尔茨，
申请(专利权)人：艾皮恩蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。