本发明专利技术涉及用于鉴定非典型单核细胞的方法，尤其是体外方法，其包括分析包含扩增子的哺乳动物基因组区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与典型单核细胞或非单核细胞细胞相比，所述区域的去甲基化或缺乏甲基化指示出非典型单核细胞。根据本发明专利技术的分析可在表观遗传水平上鉴定非典型单核细胞，并将它们与复杂样品中的所有其他细胞(例如其他血液或免疫细胞)区分开。本发明专利技术还提供了用于定量尤其是在复杂样品中的非典型单核细胞的改进方法。可以在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下，优选在全血和/或非胰蛋白酶化组织中进行所述方法。
Amplified subdomains as epigenetic markers for the identification of immune cells, especially atypical monocytes
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为用于鉴定免疫细胞尤其是非典型单核细胞的表观遗传标记的扩增子区本专利技术涉及用于鉴定非典型单核细胞的方法，特别是体外方法，其包括分析包含扩增子的哺乳动物基因组区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中当与典型单核细胞或非单核细胞细胞相比时，所述区域的去甲基化或缺乏甲基化指示出非典型单核细胞。根据本专利技术的分析可在表观遗传水平上鉴定非典型单核细胞，并将它们与复杂样品中的所有其他细胞(诸如，例如其他血液或免疫细胞)区分开。本专利技术还提供了用于定量特别是在复杂样品中的非典型单核细胞的改进方法。所述方法可以在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下，优选在全血和/或非胰蛋白酶化组织中进行。此外，本专利技术涉及用于进行上述方法的试剂盒以及其相应用途。本专利技术的一个目的是提供一种新型、更稳健的定量检测和测量哺乳动物的任何实体器官或组织内的血液或任何其他体液的非典型单核细胞的方法。
技术介绍
单核细胞是最大的白血细胞(白细胞)类型。它们构成了人体所有白细胞的2％至10％，并且其中约有一半储存在脾脏中。单核细胞是包括所有哺乳动物(包括人类)、鸟类、爬行动物和鱼类在内的脊椎动物先天免疫系统的一部分，并因此可以影响适应性免疫的过程。单核细胞可分化为巨噬细胞和髓系谱系树突细胞以引发免疫响应。单核细胞在免疫功能中起到多种作用。此类作用包括：(1)在正常状态下补充常驻巨噬细胞，以及(2)响应于炎性信号，单核细胞可以迅速迁移到组织中的感染部位。人血中至少存在三种类型的单核细胞，其不同之处为其细胞表面受体的表达。“典型”单核细胞的特征在于高水平的CD14细胞表面受体表达(CD14++CD16-单核细胞)。相反，“非典型”单核细胞表达CD14和另外共表达CD16受体。“非典型”单核细胞还可细分为显示低水平CD14表达和高CD16共表达的单核细胞(CD14+CD16++单核细胞)。“中间”单核细胞表达高水平的CD14和低水平的CD16(CD14++CD16+单核细胞)。即使个体中几乎所有细胞都含有完全相同的DNA密码的互补序列，高级生物也必须在各种类型的组织中施加并维持不同的基因表达模式。大多数基因调控是暂时的，取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持久调控是表观遗传学的主要作用-可遗传的调控模式，不改变DNA的基本遗传编码。DNA甲基化是表观遗传调控的典型形式；它充当细胞的稳定记忆，并在维持各种细胞类型的长期同一性中发挥关键作用。最近，发现了其他形式的表观遗传调控。除了“第五碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)之外，可发现第六(5-羟甲基胞嘧啶，hmC)、第七(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八(5-羧基胞嘧啶，cC)(MichaelJ.Booth等人QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience2012年5月18日,第336卷第6083期第934-937页)。提及的DNA修饰的主要靶标是两核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(“CpG位点”)；在这种情况下，胞嘧啶(C)可以进行简单的化学修饰以被甲酰化、甲基化、羟甲基化或羧基化。在人类基因组中，CG序列比预期的少得多，除了在称为“CpG岛”的某些相对密集的簇中。CpG岛经常与基因启动子相关，并且据估计，超过一半的人类基因具有CpG岛(Antequera和Bird,ProcNatlAcadSciUSA90:11995-9,1993)。DNA的异常甲基化通常与健康细胞向癌性细胞的转化有关。在观察到的作用中有全基因组的次甲基化，肿瘤抑制基因的甲基化增加以及许多致癌基因的次甲基化(由例如以下综述：Jones和Laird,NatureGenetics21:163-167,1999；Esteller,Oncogene21:5427-5440,2002；和Laird,NatureReviews/Cancer3:253-266,2003)。甲基化谱已被认为是肿瘤特异性的(即，特定基因或甚至单个CpG的甲基化模式的改变都可以诊断特定的肿瘤类型)，并且现在存在一组广泛的膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌的诊断标记(例如由Laird,NatureReviews/Cancer3:253-266,2003概述)。对于最近描述的胞嘧啶修饰之一即5-羟基甲基化，显示了氧化亚硫酸盐测序在CpG岛上作图和定量5hmC的效用(MichaelJ.Booth等人QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience2012年5月18日,第336卷第6083期第934-937页)。在与转录调控因子相关的CpG岛和长散在核元件中发现了高水平的5hmC。提示这些区域可能在胚胎干细胞中进行表观遗传重编程。WO2012/162660描述了使用DNA甲基化阵列的方法，所述DNA甲基化阵列经提供用于鉴定细胞或细胞混合物以及用于定量血液或组织中细胞分布的变化，以及用于诊断、预后和治疗疾病状况，特别是癌症。该方法使用新鲜和档案样本。Zawada等人(于：Zawada等人DNAmethylationprofilingrevealsdifferencesinthe3humanmonocytesubsetsandidentifiesuremiatoinduceDNAmethylationchangesduringdifferentiation.Epigenetics.2016年4月2日；11(4):259-72.doi:10.1080/15592294.2016.1158363.Epub2016年3月28日)使用下一代甲基测序来公开单核细胞的不同亚组的DNA甲基化组内的差异。他们进一步描述了在单核细胞中具有差异甲基化启动子区的基因，这些基因与不同的免疫学过程相关。没有提及2213扩增子内的基因组区。Illingworth等人(于Illingworth等人AnovelCpGislandsetidentifiestissue-specificmethylationatdevelopmentalgeneloci.PLoSBiol..2008年1月；6(1):e22.doi:10.1371/journal.pbio.0060022)公开了与源自血样品的粒细胞相比，单核细胞中三个不同CpG岛的甲基化模式内的变异。没有给出2213扩增子的启示。Accomando等人(于：Accomando等人QuantitativereconstructionofleukocytesubsetsusingDNAmethylation.GenomeBiol.2014年3月5日；15(3))公开了细胞谱系-特异性DNA甲基化模式将正常人白细胞亚组区分开并可用于检测和定量外周血中的这些亚组。他们使用DNA甲基化同时定量多个白细胞亚组，并鉴定区分人T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、嗜酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于鉴定样品中的非典型单核细胞的方法，其包括分析哺乳动物的2213扩增子内的基因组区域中的至少一个CpG位置的甲基化状态，其中优选地根据SEQ ID No.1定位所分析的所述区域，其中与典型单核细胞或非单核细胞相比，所述区域的去甲基化或缺乏甲基化指示出非典型单核细胞。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171027 DE 102017125335.11.用于鉴定样品中的非典型单核细胞的方法，其包括分析哺乳动物的2213扩增子内的基因组区域中的至少一个CpG位置的甲基化状态，其中优选地根据SEQIDNo.1定位所分析的所述区域，其中与典型单核细胞或非单核细胞相比，所述区域的去甲基化或缺乏甲基化指示出非典型单核细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CpG位置存在于所分析的所述2213扩增子内的任何基因的转录起始上游的5’区、启动子区、5’或3’非翻译区、外显子、内含子、外显子/内含子边界中和/或转录终止下游的3’区中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个CpG位置选自这样的CpG，其选自根据SEQIDNo.1的扩增子中的CpG位置30、89、123、169、206、242和248，并且优选地选自扩增子第2213号的片段中或根据SEQIDNo.2或3的亚硫酸氢盐转化的序列的片段中的CpG位置30、169、206和242。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐可转化性分析包括选自甲基化特异性酶促消化、亚硫酸盐测序的方法，选自启动子甲基化、CpG岛甲基化、MSP、重甲基、荧光定量法、Ms-SNuPE的分析，以及其它依赖于检测扩增的DNA的方法。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括基于比较所分析的2213扩增子中的所述甲基化频率的相对量与对照基因例如GAPDH中的甲基化频率的相对量来定量非典型单核细胞的相对量。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品选自哺乳动物体液，包括人血样品或组织、器官或细胞类型血样品、血液淋巴细胞样品或其级分。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯文·欧莱克，
申请(专利权)人：艾皮恩蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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