本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种用于分析肠道微生物的引物组及其应用，所述引物组包括第一正向引物和第一反向引物；其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P5接头序列、第一标签序列、第一间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3‑V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P7接头序列、第二标签序列、第二间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3‑V4区特异性反向引物。本发明专利技术引物组合物采用一步法扩增获得测序文库，其中包含了随机碱基，增加了文库序列的复杂度，降低了phix的比例，保证更多测序质量，提高了文库的覆盖度。
【技术实现步骤摘要】
一种用于分析肠道微生物的引物组及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种用于分析肠道微生物的引物组及其应用，具体涉及通过一轮PCR构建文库，分析分类肠道微生物的引物组，其组成的检测试剂盒及应用。
技术介绍
人体肠道中共生着结构复杂、数量庞大的微生物群，这些微生物通过长期与人类协同进化，已成为维持人类健康不可忽视的重要“功能器官”。越来越多的研究证据表明，肠道菌群失调与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、炎症性肠炎、消化道肿瘤等多种疾病的发生密切相关。因此探寻肠道菌群与疾病发生发展之间的关系对疾病的预防和治疗具有重要的意义。许多经典方法在肠道菌群研究方面一直沿用，如研究菌落特征、菌体形态、生理生化特征、代谢产物等指标，这些传统方法主要是建立在纯培养技术之上的，但是肠道中有很多微生物还无法实现纯培养；可以纯培养的微生物又存在耗时、费力且操作复杂等问题，而且很大程度上受培养条件的制约，这往往造成研究结果的不稳定性，导致不能全面、客观地反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的快速发展为肠道菌群研究提供了全新的方法和思维，它克服了传统方法的限制，使得科研工作者可以从基因水平估计出种的丰度和均匀度，分清楚种的变异情况，从而客观地认识微生物天然的生态状况。该领域目前对肠道微生物的研究基本上基于16SrRNA测序或者宏基因测序进行分析。16SrRNA基因是对原核微生物进行系统分类研究最常用的分子标志物。16SrRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，一般由10个保守区和9个高变区组成，保守区在细菌间差异不大，高变区随亲缘关系不同而存在差异。16SrRNA被认为是最适用于细菌系统发育和分类鉴定的指标。对16SrRNA高变区进行测序，可将菌群精确分类到属甚至种的级别。肠道微生物基因扩增子测序正是基于上述16SrRNA基因的特点，选择1-2个高变区，利用保守区设计通用引物进行PCR扩增，再对高变区进行测序分析和菌种鉴定，而因为16SrRNA的V3-V4区在细菌和古菌中的覆盖度均较高，所以被认为是16SrRNA测序最佳选择区域。基于上述问题，如何设计引物，获得肠道微生物高质量、较为完整的基因组DNA显得尤为重要，尤其对目前16SrRNA测序技术进行改进，获得更好质量的测序分析数据是必要的，才能为精准获得更多肠道微生物生物学信息，并为临床预防与治疗提供指导打下基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种分析肠道微生物的引物组及其应用，本专利技术引物组采用一步法扩增获得测序文库，其中包含了随机碱基，增加了文库序列的复杂度，简单、快捷、获得质量高的测序文库，以提高肠道微生物组基因组序列捕获效率。第一方面，本专利技术提供了一种用于分析肠道微生物的引物组，其包含：第一正向引物和第一反向引物；其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P5接头序列、第一标签序列、第一间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16SrRNAV3-V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P7接头序列、第二标签序列、第二间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16SrRNAV3-V4区特异性反向引物。本专利技术中，专利技术人发现，通过采用一步法扩增获得测序文库，所述引物组包含V3-V4位点特异性简并引物，提高了扩增片段覆盖率、检测特异性及灵敏度，结合数据分析，可获得更丰富的微生物组信息，所述引物组引入2bp的随机碱基，增加了文库序列的复杂度，降低了phix的比例，保证更多测序质量。根据本专利技术，所述第一正向引物的特异性正向引物的核酸如SEQIDNO.1所示，所述第一反向引物的特异性反向引物的核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述SEQIDNO.1-2所示的核酸序列如下：特异性正向引物(SEQIDNO.1)：CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT；特异性反向引物(SEQIDNO.2)：GGACTACNVGGGTWTCTAATCC；其中，特异性正向引物中的R选自A/G中的任意一个碱基，B选自T/C/G中的任意一个碱基，S选自C/G中的任意一个碱基，K选自T/G中的任意一个碱基，V选自A/C/G中的任意一个碱基；特异性反向引物中的N选自A\G\C\T中的任意一个碱基，V选自A/C/G中的任意一个碱基，W选自A/T中的任意一个碱基。本专利技术中，所述特异性正向引物通过R、B、S、K和V按不同的排列组合所形成的72种序列，所述特异性正向引物为同时含有这72种所述特异性正向引物的混合物；所述特异性反向引物通过N、V和W按不同的排列组合所形成的24种序列，所述特异性反向引物为同时含有这24种所述特异性反向引物的混合物。优选地，所述P5接头序列如SEQIDNO.3所示，所述P7接头序列如SEQIDNO.4所示，所述SEQIDNO.3-4所示的核酸序列如下：P5接头序列(SEQIDNO.3)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；P7接头序列(SEQIDNO.4)：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT.根据本专利技术，所述第一标签序列为P5标签序列，其核酸序列如SEQIDNO.5-14所示，所述核酸序列如下：序列接头名称SEQIDNO.5CTCTCTATS502SEQIDNO.6TATCCTCTS503SEQIDNO.7GTAAGGAGS505SEQIDNO.8ACTGCATAS506SEQIDNO.9AAGGAGTAS507SEQIDNO.10CTAAGCCTS508SEQIDNO.11CGTCTAATS510SEQIDNO.12TCTCTCCGS511SEQIDNO.13TCGACTAGS513SEQIDNO.14TTCTAGCTS515根据本专利技术，所述第二标签序列为P7标签序列，其核酸序列如SEQIDNO.15-24所示，所述核酸序列如下：本专利技术中，所述引物组还通过引入双index(标签)的设计，可以更大程度地混合更多的样本。根据本专利技术，所述第一间隔序列如SEQIDNO.25所示，所述第二间隔序列如SEQIDNO.26所示，所述SEQIDNO.25-26所示的核酸序列如下：第一间隔序列(SEQIDNO.25)：TATGGTAATT；第二间隔序列(SEQIDNO.26)：AGTCAGCCAG；本专利技术中，所述引物组还包括间隔序列，所述间隔序列可以改善长引物扩增问增问题，减少二级结构等的产生。根据本专利技术，所述引物组包含2bp的随机碱基NN，所述N可以任意的选自A\T\G\C中的任意一个碱基，所述随机碱基增加了文库序列的复杂度，降低了phix的比例，保证更多测序质量。本专利技术中，所述第一正向引物通过P5接头+第一标签序列+第一间隔序列+NN+肠道微生物16SrRNAV3-V4区特异性正向引物的序列组合得到，具体为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCT-[i5]-TATGGTAATTNNCCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT，其中，i5为P5标签序列，N为A\T\G\C中的任意一个碱基，R选自A/G中的任意一个碱基，B选自T/C/G中的任意一个碱基，S选自C/G中的任意一个碱基，K选自T/G中的任意一个碱基，V选自A/C/G中的任意一个碱基；所述第二反向引本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于分析肠道微生物的引物组，其包含：第一正向引物和第一反向引物；其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P5接头序列、第一标签序列、第一间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3‑V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P7接头序列、第二标签序列、第二间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3‑V4区特异性反向引物。
【技术特征摘要】
1.一种用于分析肠道微生物的引物组，其包含：第一正向引物和第一反向引物；其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P5接头序列、第一标签序列、第一间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16SrRNAV3-V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的五个部分：P7接头序列、第二标签序列、第二间隔序列、2bp的随机碱基序列和肠道微生物16SrRNAV3-V4区特异性反向引物。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一正向引物的特异性正向引物的核酸如SEQIDNO.1所示，所述第一反向引物的特异性反向引物的核酸序列如SEQIDNO.2所示；其中，R选自A/G中的任意一个碱基，B选自T/C/G中的任意一个碱基，S选自C/G中的任意一个碱基，K选自T/G中的任意一个碱基，V选自A/C/G中的任意一个碱基；N选自A\G\C\T中的任意一个碱基，V选自A/C/G中的任意一个碱基，W选自A/T中的任意一个碱基；优选地，所述P5接头序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述P7接头序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述第一标签序列为P5标签序列，其核酸序列如SEQIDNO.5-14所示；优选地，所述第二标签序列为P7标签序列，其核酸序列如SEQIDNO.15-24所示；优选地，所述第一间隔序列如SEQIDNO.25所示；优选地，所述第二间隔序列如SEQIDNO.26所示。3.一种分析肠道微生物的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的引物组。4.一种肠道微生物的分析方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的引物组，包括如下步骤：(1)样本基因组DNA的提取；(2)扩增子文库的构建：采用如权利要求1或2所述的引物组，进行一轮PCR扩增，构建高通量测序文库；(3)数据分析；优选地，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或口腔细胞中的任意一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：周燕，朱永亮，穆延召，
申请(专利权)人：苏州普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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