快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法，该试剂盒通过对被检测样品DNA的PCR扩增，能快速检测样品中的猪丹毒杆菌和猪链球菌。二重PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入二对引物，可以检测临床样品中两种细菌的单个感染和混合感染，因此建立这两种致病菌的二重PCR检测试剂盒及检测方法，对快速、准确的鉴定临床样品中的致病菌和致病菌的分子流行病学调查均具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法
本专利技术涉及PCR检测试剂盒，具体地指一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法。
技术介绍
猪丹毒杆菌可引起猪的败血症、多发性关节炎和心内膜炎等，人对猪丹毒杆菌易感，表现为皮肤型或败血症，称为“类丹毒”。农业部2013年发布的全国生猪疫情报告显示，猪丹毒病例的发病数量远高于猪瘟、高致病性猪蓝耳病、猪囊虫病、炭疽、猪肺疫及布鲁氏菌病。猪链球菌是中国猪源链球菌病的最主要病原。猪丹毒杆菌有25个血清型，我国流行的主要血清型是1a和2型。王雷等利用SpaA基因设计PCR引物，能够快速鉴定猪丹毒杆菌，并能区分猪丹毒弱毒疫苗株和其他野生流行株。2003年OkwumabuaO利用猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)设计引物来检测猪链球菌，近年来，大量的临床检测表明gdh基因是猪链球菌的特异性基因，仅存在于猪链球菌中且广泛存在于猪链球菌所有血清型中。临床常用PCR方法检测样品中猪丹毒杆菌和猪链球菌和存在，但多次单个的PCR反应会造成不必要的浪费，同时临床上有大量混合感染病例，对于猪丹毒杆菌和猪链球菌的混合感染样品，单个PCR反应很难进行全面、快速的检测。因此，迫切需要设计猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测的引物对及试剂盒及方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对及试剂盒和方法。其在PCR基础上产生的双重PCR方法，以两对引物代替单一引物，能够更加快捷的扩增不同细菌的目的片段，大大缩短了鉴定时间；可以为两种致病菌的临床检测提供更加简便快捷的技术手段，对防控猪丹毒杆菌和猪链球菌具有重要的意义。为实现上述目的，本专利技术提供的一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对，所述二重PCR引物对为：本专利技术还提供了一种猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测试剂盒，所述二重PCR试剂盒包括引物混合液，所述引物混合液中含有下述引物对：进一步地，所述引物混合液中引物spaA-1F、spaA-1R、gdh-1F和gdh-1R浓度均为45～50μM。再进一步地，所述二重PCR试剂盒还包括2×PCR反应缓冲液和ddH2O，其中2×PCR反应缓冲液中含有DNA聚合酶EasyTaq、2.5mM的Mg2+浓度氯化镁和dNTPs。本专利技术还提供了一种利用上述二重PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)采用煮沸法提取待检样品基因组DNA，2)使用上述试剂盒进行PCR，得到PCR产物，电泳完成后于凝胶成像系统下观察结果：若片段长度为770bp，则说明待检样品为猪丹毒杆菌；若片段长度为525bp，则说明待检样品为猪链球菌；若凝胶成像系统下观察到有两条目的片段，且从上到下两条片段长度依次为770bp和525bp，则说明待检样品有猪丹毒杆菌和猪链球菌。作为优选方案，所述步骤1)中，煮沸法提取方法：1)首先将待检样品组织剪碎匀浆加入ddH2O混匀并经蛋白酶K消化处理，2)再经沸水浴后立即冰浴，离心收集上清即为待检样品基因组DNA。作为优选方案，所述步骤2)中，：a.PCR反应体系为：b.PCR反应条件为：(1)预变性：94℃2分钟；(2)循环35次变性：94℃30秒，退火：55℃30秒，延伸：72℃1分钟；(3)终延伸：72℃2分钟。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的二重PCR检测试剂盒可在同一PCR反应中同时检测两种细菌，可大幅节约检测成本和节省时间。本方法不需要复杂的试验仪器，不需要无菌操作环境，煮沸法提取基因组操作简单。附图说明图1为二重PCR的阳性对照和阴性对照图，图中，M为DNAMarker；孔1为二重PCR阳性对照；孔2、3分别为猪丹毒杆菌和猪链球菌各自的阳性对照，孔4为阴性对照；图2为二重PCR检测试剂盒的特异性试验，图中，M为DNAMarker，孔1为阳性对照，孔2为阴性对照，孔3-11：猪丹毒杆菌、猪链球菌、马链球菌兽疫亚种、大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌；图3为二重PCR检测试剂盒的敏感性试验，M为DNAMarker，孔1PCR产物模板为阳性对照；孔2PCR产物模板为阴性对照；3-8PCR产物模板为猪丹毒杆菌，细菌量分别为2×105、2×104、2×103、2×102、2×10、2cfu；孔9-14PCR产物模板为猪链球菌，细菌量分别为2×105、2×104、2×103、2×102、2×10、2cfu。具体实施方式为了更好地解释本专利技术，以下结合具体实施例进一步阐明本专利技术的主要内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1二重PCR引物对和试剂盒的制备使用PrimerPremier6软件分别对SpaA基因和gdh基因(其序列如序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2)设计PCR扩增引物，并委托武汉擎科生物工程有限公司合成引物。引物合成后用ddH2O稀释到50μM，引物序列如下：每个试剂盒检测100个样品，按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)：1、2×PCR反应缓冲液(含有DNA聚合酶EasyTaq、2.5mM的Mg2+浓度氯化镁、dNTPs)：1.25mL2、引物混合液(含有spaA-1F、spaA-1R、gdh-1F和gdh-1R浓度均为50μM)：400μL3、阳性对照溶液：100μL4、ddH2O：1mLa.PCR反应体系为：b.PCR反应条件为：(1)预变性：94℃2分钟；(2)循环35次变性：94℃30秒，退火：55℃30秒，延伸：72℃1分钟；(3)终延伸：72℃2分钟。实施例2：猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测试剂盒制备及其阳性对照的检测分别取分离鉴定的猪丹毒杆菌SE10和猪链球菌SC19，使用煮沸法提取两个细菌的基因组；按下述序列合成2对引物，稀释至50μM备用。spaA-1F：5’-CAGCAATGCCACTACAAACAG-3’,spaA-1R：5’-TACAACTTGAATTTGGCGATT-3’,gdh-1F：5’-AAGCAGTCAAAGCCCGC-3’,gdh-1R：5’-GGAGGCGTTTGTATTGACC-3’；使用大连宝生物公司的DNA聚合酶EasyTaq及其配套的10×Buffer，反应体系为：引物混合液4μl(含spaA-1F、spaA-1R、gdh-1F、gdh-1R各1μl)，PCR缓冲液19.5μl(含dNTPs2μl，10×Buffer2.5μl，ddH2O15μl)，EasyTaq(大连宝生物公司)0.5μl，标本DNA1μl。使用微量移液器吹吸混匀，高速瞬时离心。反应条件为：(1)预变性：94℃2分钟，(2)循环35次：变性：94℃30秒；退火：56℃30秒；延伸：72℃1分钟，(3)终延伸：72℃2分钟。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。回收产物插入到载体pMD18-T上，转化进入大肠杆菌，使用含氨苄青霉素的培养基进行培养，并将阳性克隆送上海生工公司测序鉴定。测序结果表明目的片段已正确插入载体中。大肠杆菌即为含目的片段载体的细菌。使用上海生工公司质粒提取试剂盒提取大肠杆菌的质粒，两种重组质粒按1:1混合，使用ddH2O调整为100ng/μl即为本检测试剂盒中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对，其特征在于：所述二重PCR引物对为：猪丹毒杆菌引物对：spaA‑1F：CAGCAATGCCACTACAAACAG，spaA‑1R：TACAACTTGAATTTGGCGATT；猪链球菌引物对：gdh‑1F：AAGCAGTCAAAGCCCGC，gdh‑1R：GGAGGCGTTTGTATTGACC。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR引物对，其特征在于：所述二重PCR引物对为：猪丹毒杆菌引物对：spaA-1F：CAGCAATGCCACTACAAACAG，spaA-1R：TACAACTTGAATTTGGCGATT；猪链球菌引物对：gdh-1F：AAGCAGTCAAAGCCCGC，gdh-1R：GGAGGCGTTTGTATTGACC。2.一种猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述二重PCR试剂盒包括引物混合液，所述引物混合液中含有下述引物对：猪丹毒杆菌引物对：spaA-1F：CAGCAATGCCACTACAAACAG，spaA-1R：TACAACTTGAATTTGGCGATT；猪链球菌引物对：gdh-1F：AAGCAGTCAAAGCCCGC，gdh-1R：GGAGGCGTTTGTATTGACC。3.根据权利要求2所述猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物混合液中引物spaA-1F、spaA-1R、gdh-1F和gdh-1R浓度均为45～50μM。4.根据权利要求2或3所述猪丹毒杆菌和猪链球菌二重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述二重PCR试剂盒还...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，吴超，康超，朱伟峰，李敬涛，孙小美，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42