肝再生相关lncRNA及其筛选方法、抑制剂和应用技术

本发明专利技术涉及筛选肝再生相关长链非编码RNA(long non‑coding RNA，lncRNA)的方法以及lncRNA TCONS_00027980的抑制剂及其应用。具体是构建了大鼠2/3肝切除模型，采用大鼠lncRNA array v 2.0芯片筛选出肝再生中的差异表达lncRNA，用关联推定法预测了lncRNA的功能，筛选出了肝再生相关的lncRNA，包括lncRNA TCONS_00027980，其转录本核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据该序列，设计并合成了其抑制剂，本发明专利技术提供的抑制剂能够抑制体外培养的BRL‑3A细胞的lncRNA TCONS_00027980表达，促进该细胞增殖。本发明专利技术可为肝移植预后辅助治疗提供了新的药物靶点，具有良好的应用前景和理论价值。

【技术实现步骤摘要】
肝再生相关lncRNA及其筛选方法、抑制剂和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种肝再生相关长链非编码RNA及其抑制剂，以及在制备调节肝细胞增殖的制剂中的应用。
技术介绍
肝是人和动物体内最重要的器官之一，承担着多种生理功能。肝参与糖类、脂类、蛋白质等物质的代谢过程。肝创伤、手术、毒物、感染等因素导致肝损伤后肝细胞的重新修复，即通过细胞增殖及分化等生理活动恢复肝原有结构和功能的过程为肝再生。肝再生涉及细胞激活、细胞去分化、细胞增殖、细胞凋亡和组织结构重建等多个生理生化过程，包括microRNAs在内的多种因素与肝结构、功能、疾病发生等密切相关。因此，阐明肝再生的分子机理，对肝创伤的修复、肝移植、肝病药物开发、肝病治疗及预防等均有重要意义。长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)是指核苷酸数大于200nt的非编码RNA转录本。lncRNA种类丰富，功能复杂，位于不同的亚细胞核区域，在不同物种间序列保守性低，有组织与发育阶段特异性，同时又是具有快速进化潜力的非编码RNA分子。lncRNA可转录自基因与非基因区域，包括基因的上游区域、基因间区域、基因内含子区域等，大多数的lncRNA被确定是转录和翻译中的关键调节因子，在细胞正常功能发挥中有着重要的影响。比如参与染色质重塑、转录及转录后调节、细胞内物质运输、细胞核亚结构形成、干细胞多能性、体细胞重编程、发育调节和疾病发生等。在发挥这些功能时，lncRNA通过不同的作用途径及方式实现对基因表达的调节，包括顺式调节与反式调节方式。另外，lncRNA可以借助蛋白质与microRNA网络这两种不同途径来发挥具体的作用。lncRNA虽没有编码蛋白质的能力，但已有研究证明其参与细胞增殖、细胞生长、细胞分化、凋亡等多种生理活动。并且已证实多种疾病尤其是癌症如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等都涉及到lncRNA的异常表达。以RNA为靶点的药物研究新方向已得到越来越多的重视，通过设计小分子药物、反义寡核苷酸、核糖酶等方法作用于RNA，这应当是未来药物研发的新方向。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)TCONS_00027980的应用方法，具体是利用lncRNATCONS_00027980为靶点调节肝细胞增殖。一种筛选肝再生相关长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)的方法，所述方法包括：1)构建肝再生大鼠模型；2)采用大鼠lncRNAArrayv2.0芯片筛选，获得出肝再生过程中差异表达的lncRNA；3)通过关联推定法预测步骤2)中差异表达的lncRNA的功能，筛选出了肝再生相关的lncRNA。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤1)中所述大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，所述肝再生大鼠模型为将大鼠肝脏切除2/3。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)中所述差异表达的lncRNA为监测肝切除处理后0、2和6h时差异表达的lncRNA。在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤3)中所述的关联推定法是通过将每条lncRNA的表达值与所有差异表达基因的表达值进行共表达分析，找到每条lncRNA对应的共表达靶基因集合，对每一条lncRNA的靶基因集合进行GO和KEGG功能富集分析，以预测每条lncRNA的功能。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述每条lncRNA对应的共表达靶基因为与特定lncRNA表达值相关系数绝对值大于0.8，且相关性检验的p值小于0.05的基因。本专利技术还提供了一种肝再生相关长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)，所述lncRNA是通过上述方法筛选得到的；优选地，所述肝再生相关长链非编码RNA为lncRNATCONS_00027980。本专利技术进一步提供了一种用于调节肝细胞增殖的抑制剂，所述抑制剂是用于调节lncRNATCONS_00027980转录本核苷酸序列表达水平的DNA或RNA；优选地，所述抑制剂是基于lncRNATCONS_00027980转录本核苷酸序列设计的siRNA，所述lncRNATCONS_00027980转录本核苷酸序列为SEQIDNO.1。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述抑制剂为6种siRNA中的一种或多种；1)siRNA-1：SEQIDNO：6atgatgtgggatgtacaag2)siRNA-2：SEQIDNO：7tgcttgatgatgtaggtcc3)siRNA-3：SEQIDNO：8tcattgttgatttgtcagc4)siRNA-4：SEQIDNO：9agccatgatgtgggatgtac5)siRNA-5：SEQIDNO：10cctccttccttcatgtggac6)siRNA-6：SEQIDNO：11ccctcctcgtgtgattgcag。本专利技术还提供了一种用于调节肝细胞增殖的制剂，所述制剂包含如权利要求8或9所述的抑制剂。该制剂可以是医疗药物组合物，也可以是用于实验目的的试剂，例如加入药学上可接受的辅料，或是实验技术中的溶剂等。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术成功筛选出lncRNATCONS_00027980，其可作为调节肝细胞增殖的靶点，lncRNATCONS_00027980的抑制剂可进一步用于制备促进肝细胞增殖的制，本专利技术可为肝移植预后辅助治疗提供强有力的分子生物学工具，具有重要的临床意义和应用前景。附图说明图1为用MTT法检测lncRNATCONS_00027980的抑制剂对BRL-3A细胞增殖活性的影响；图2A、图2B和图2C展示了lncRNATCONS_00027980的抑制剂对BRL-3A细胞周期的影响；其中图2A为对照组的流式细胞仪结果、图2B为试验组的流式细胞仪结果，图2C为对照组和试验组的细胞周期对比的柱形图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材实验大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8:00-20:00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partialhepatectomy，PH)与假手术对照(shamoperation，SO)各9组。PH组按Higgins和Anderson方法进行，SO组除不切除肝叶外，其他同PH。手术后2、6h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如RNALater)中，于-20℃保存备用。实施例2：lncRNAs的高通量测序取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按总RNA提取试剂盒(Ambion，美国)操作指南提取和纯化总RNAs。用琼脂糖凝胶电泳(180V，0.5h)检测总RNA质量，28SrRNA∶18SrRNA约为2∶1，分别测定OD260和OD280，在OD260/OD280≥2.0，视为RNA合格。miRNAs的定性和定量分析由上海伯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选肝再生相关长链非编码RNA(long non‑coding RNA，lncRNA)的方法，其特征在于，所述方法包括：1)构建肝再生大鼠模型；2)采用大鼠lncRNA Array v 2.0芯片筛选，获得出肝再生过程中差异表达的lncRNA；3)通过关联推定法预测步骤2)中差异表达的lncRNA的功能，筛选出了肝再生相关的lncRNA。

【技术特征摘要】
1.一种筛选肝再生相关长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)的方法，其特征在于，所述方法包括：1)构建肝再生大鼠模型；2)采用大鼠lncRNAArrayv2.0芯片筛选，获得出肝再生过程中差异表达的lncRNA；3)通过关联推定法预测步骤2)中差异表达的lncRNA的功能，筛选出了肝再生相关的lncRNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，所述肝再生大鼠模型为将大鼠肝脏切除2/3。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述差异表达的lncRNA为监测肝切除处理后0、2和6h时差异表达的lncRNA。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的关联推定法是通过将每条lncRNA的表达值与所有差异表达基因的表达值进行共表达分析，找到每条lncRNA对应的共表达靶基因集合，对每一条lncRNA的靶基因集合进行GO和KEGG功能富集分析，以预测每条lncRNA的功能。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述每条lncRNA对应的共表达靶基因为与特定lncRNA表达值相关系数绝对值大于0.8，且相关性检验的p值小于0.05的基因。6.一种肝再生相关长链非编码RNA(1ongnon-codingRNA，lncRNA)，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐存栓，张婷，靳伟，张春艳，李俊，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41