一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽胞杆菌中编码丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸消旋酶(alr)和葡萄糖脱氢酶(gdh)基因串联插入到改造过的质粒pET‑22bNS上，构建三基因共表达载体pET‑22bNS‑G/A/A。所构建的三基因共表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，以重组菌株全细胞催化反应3h后L‑丙氨酸和D‑丙氨酸的产量最高，分别为7.0和6.5mg/mL，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。本发明专利技术所构建的三基因共表达载体具有高效合成DL‑丙氨酸的能力，具有较好的应用价值。

A total of three gene expression vector and application for synthesis of DL alanine

The invention discloses a synthesis of DL three gene ala co expression vectors construction and application. According to the principle of isocaudarner, will leave the strong Bacillus encoding alanine dehydrogenase (ALD), alanine racemase (ALR) and glucose dehydrogenase (GDH) gene series inserted into modified plasmid pET 22bNS, pET 22bNS G/A/A carrier co expression of Gou Jiansan gene. The total of three gene expression vector into E.coli BL21 (DE3), the recombinant strain whole cell catalytic reaction after 3H L and D alanine alanine yield was the highest, 7 and 6.5mg/mL respectively, the highest synthesis efficiency of the two were 56.4 and 51.9mg/mL/d. The ability of carrier with efficient synthesis of DL alanine co expression of three gene of the present invention is constructed, and it has good application value.

【技术实现步骤摘要】
一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用
本专利技术涉及一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成

技术介绍
DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，广泛应用于食品、化妆品和制药等方面，国内外市场对其需求量日渐增大。现有技术中，DL-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法、化学合成法和生物酶法，其中，化学合成法反应机制复杂、工艺过程长、生产成本高；发酵法生产周期长、设备投资大、分离复杂、成本高；生物酶法是利用微生物所产生的酶催化底物转化生成DL-丙氨酸，该方法具有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但由于所需酶蛋白的稳定性差、活性低、生产成本高。正是由于这些缺点的存在，上述三种方法均不符合工业化生产的要求，难以满足市场的需求。因此，开发高效合成DL-丙氨酸的生产方法具有非常重要的意义。早在1997年日本京都大学KenjiSoda教授等提出利用4酶偶联合成D-氨基酸(Galkinetal.,1997)，即利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶协同作用参与催化合成D-氨基酸，该方法转化效率较高，但高活性、高稳定性的酶蛋白的获得是此方法能否成功开发的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体。本专利技术的目的还在于提供一种含合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法。本专利技术基于上述方法，以葡萄糖脱氢酶替代甲酸脱氢酶，用于催化反应中还原型辅酶NADH的再生；利用同尾酶原理将葡萄糖脱氢酶(gdh)、丙氨酸脱氢酶(ald)和丙氨酸消旋酶(alr)三基因串联构建多基因共表达载体，使每个基因均带有独立的启动子(T7启动子)、核糖体结合位点(RBS)、终止子(T7终止子)等表达调控元件，各基因的表达相对独立；以含有多基因共表达载体的重组菌体全细胞进行催化，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新途径。本专利技术的目的是这样实现的：一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其核苷酸序列由SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4和SEQIDNo.6共同构成。其中：(1)SEQIDNo.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；(2)SEQIDNo.2所示序列为编码基因gdh的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；(3)SEQIDNo.4所示序列为编码基因ald的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；(4)SEQIDNo.6所示为编码基因alr的核苷酸序列。本专利技术还提供三个编码基因gdh、ald和alr的氨基酸序列，如SEQIDNo.3、SEQIDNo.5和SEQIDNo.7所示。本专利技术还提供含有上述三基因的共表达载体及宿主细胞。本专利技术还提供含有上述三基因共表达载体的工程菌。本专利技术还提供上述三基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域的核苷酸序列，设计定点突变引物，改造获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述突变引物为：Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；(2)以商业载体pET-22b(+)为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的扩增产物替换商业载体的表达区域，构建能够容纳多个基因共同表达的载体pET-22bNS；(3)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌OF4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；所述引物对为：Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′(4)以假坚强芽胞杆菌OF4基因组DNA为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物逐一连入改造后的载体pET-22bNS中，构建三基因共表达载体；(5)将上述三基因共表达载体转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶蛋白。制备方法的优选条件：步骤(2)中所述表达载体为pET系列中的任意一种。步骤(5)中所述工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。本专利技术进一步提供上述三基因共表达载体的应用，具体是将三基因共表达载体用于生物法生产DL-丙氨酸。具体地，本专利技术是从假坚强芽胞杆菌(Bacilluspseudofirmus)OF4中获得葡萄糖脱氢酶(GenBank:ADC51909.1)、丙氨酸脱氢酶(GenBank:ADC50010.1)和丙氨酸消旋酶(GenBank:ADC50009.1)基因，通过PCR扩增获得目的基因，并将基因片段与质粒pET-22bNS连接，构建重组表达质粒pET-22bNS-Gdh、pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr；利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和SpeI双酶切获取带有启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件的目的基因片段，逐一与经BglII和NheI双酶切处理的相应表达载体相连接，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-G/A/A；该重组质粒转化大肠杆菌感受态，构建三基因共表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET-22bNS-G/A/A；经30℃诱导15h后收集菌体，以重组菌体全细胞参与催化反应，在37℃下180rpm振荡反应3h，经检测，反应液中L-丙氨酸和D-丙氨酸的产量分别为7.0和6.5mg/mL，二者的合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。本专利技术取得以下有益效果：本专利技术通过同尾酶的原理构建了葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶三基因共表达载体，每个基因均带有独立的表达调控元件；通过转化获得了含有三基因共表达载体的基因工程菌，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新方法，具有较好的推广应用价值。附图说明图1为pET-22bNS改造区域PCR产物电泳图谱。图1中M：2000bpDNAmarker；1：pET-22bNS改造区域PCR产物。图2为质粒pET-22bNS-Ald双酶切电泳图谱。图2中M：1.0kbDNAmarker；1：质粒pET-22bNS-Ald的双酶切产物。图3为质粒pET-22bNS-Alr双酶切电泳图谱。图3中M：1.0kbDNAmarker；1&2：质粒pET-22bNS-Alr本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成，其中：(1)SEQ ID No.1所示序列为改造后表达载体pET‑22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；(2)SEQ ID No.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；(3)SEQ ID No.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；(4)SEQ ID No.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4和SEQIDNo.6共同构成，其中：(1)SEQIDNo.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；(2)SEQIDNo.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；(3)SEQIDNo.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；(4)SEQIDNo.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。2.一种编码如权利要求1所述三个酶蛋白Gdh、Ald和Alr，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNo.5和SEQIDNo.7所示，其中SEQIDNo.3中第188位的天门冬氨酸(D)为同义突变(GAT→GAC)，SEQIDNo.5中第107位的赖氨酸(L)为同义突变(CTA→CTC)。3.一种含权利要求1所述三基因共表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)根据质粒pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域核苷酸序列信息，设计突变引物，通过PCR突变技术引入限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述引物为：Nhe-F01:5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；Spe-F01:5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；Spe-R01:5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；以质粒pET-22b(+)为PCR模板，使用上述设计的引物，利用PCR突变技术将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得质粒pET-22bNS；(2)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌OF4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，通过PCR扩增获得目的DNA；所述各基因扩增引物为：Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′以来自假坚强芽胞杆菌(Bacillus...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠建松，徐书景，王珊珊，孙晴晴，蔡晓，赵宝华，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：河北,13