生物组织样品的分子概况的空间作图制造技术

提供了一种方法，其能够以高分辨率对组织样品的核酸进行空间作图，而不会牺牲从下一代测序中可获得的多重化程度。该方法基于将条形码化的寡核苷酸探针的图案应用至组织样品中的目标区域中的预定义位置上。基于条形码，可以将每种分析的核酸分配至样品内的特定位置。可以使用各种印刷技术，并且可以采用不同的图案化方式，如具有特定间距的规则阵列，或者替代地，具有限定的目标区域而没有形状限制的基于对象的图案化。

Spatial mapping of molecular profiles of biological tissue samples

It provides a way to map the nucleic acid of tissue samples with high resolution, without sacrificing the degree of multiplicity obtained from next generation sequencing. The method is based on the application of the barcode oligonucleotide probe into the predefined position in the target area of the tissue sample. Based on bar code, each analysis of nucleic acids can be assigned to a specific location in the sample. Various printing technologies can be used, and different patterning methods can be adopted, such as regular arrays with specific spacing or alternatively, object based patterning with limited target area without shape restriction.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物组织样品的分子概况的空间作图专利
提出了一种能够以高分辨率将组织样品的核酸进行空间作图的方法。该方法基于应用考虑组织信息的结合样品中的核酸的包含条形码序列的寡核苷酸探针的图案。专利技术背景目前，病理学家正在进行各种形式的组织和细胞的显微镜检查。显微镜图像揭示了作为诊断基础的关于形态(例如细胞类型、分化等)的信息。在病理学家想要更详细地检查组织/细胞的情况下，使用生物标志物特异性染色方案，诸如在乳腺癌的情况下的ER、PR和HER2。某些分子测试通过所谓的原位杂交对DNA和RNA进行。然而，以此方法，靶标的数量是有限的。为了改善分层，进行分子诊断测试以测试基因表达(例如OncoTypeDX,Mammaprint)或者借助于测序(例如Sanger或下一代测序)和表达概况分析(例如，微阵列、RNAseq、RT-PCR)来寻找可作用的突变，如KRAS、EGFR等。肿瘤组织在组成上是异质的，并且被基质和浸润性免疫细胞包围。这种空间异质性可以影响分子分析，因为肿瘤细胞的DNA和RNA被未被分析靶向的细胞的DNA和RNA所稀释。为了克服该问题，在载片上选择组织/细胞的目标区域(ROI)，并且例如通过刮擦或(激光捕获)微解剖技术从载片上移除，以在分子测定和/或蛋白质组学测定(蛋白组合物等)中处理和分析。当收集ROIs时，仅储存有限的位置信息，而收集的材料经常源自不同的ROIs，或将ROIs合并，随后一起分析。在激光捕获微解剖的情况下，可以分开收集小区域，但这是耗时的并且不允许对组织/细胞的系统分析。分子分析耗时且昂贵。对于分子概况的更高分辨率作图，这导致大量的分子测试，其成本对于临床实践将太高。肿瘤异质性和组织结构还可以是潜在的诊断参数，因为它们可以提供关于肿瘤的克隆进化及其侵袭性的线索。因此，通过从载片去除ROI以进行进一步分子分析，该信息丢失。已经基于对分子和蛋白生物标志物的原位染色创建了异质性图。参见例如Almendro,等人,2014,CellReports,6:514-527。Armani等人,LabChip,2009,9(24):3526-3534和Armani等人,AnalBioanalChem,2011,400:3383-3393描述了不同的方法，其中将组织切片压入孔板中，其中在每孔中进行单次qPCR或RT-qPCR反应。随后，生成扩增的靶标的2D图。US20140066318A1描述了在其上放置组织样品的基底上的探针阵列。所述探针结合靶核酸，并且提取结合的探针和靶核酸且用于分子诊断。在本申请中，我们描述了一种方法，其通过有效地使用每个样品的多重化ROIs而允许核酸的高空间分辨率作图，而不会牺牲从下一代测序可得的多重化程度。本专利技术的方法基于应用考虑组织信息的包含条形码序列的寡核苷酸探针的图案，其中所述寡核苷酸探针结合样品中的核酸。可以使用各种应用技术，并且可以采用不同的图案化方式，如具有特定间距(pitch)的规则阵列，或者替代地，具有限定的目标区域而没有形状限制的基于对象的图案化。本专利技术的一个关键方面是基于组织信息和待回答的问题鉴定ROI并个别地定义图案的空间分辨率。目标区域以及图案的空间分辨率可以响应于在应用试剂之前对组织的基于图像的分析来选择。通过鉴定至少一个ROI并且仅向ROI提供寡核苷酸探针，需要较少种类的寡核苷酸探针来提供空间图。此外，单独设计空间分辨率图案而不限于阵列格式，允许个别确定待使用的寡核苷酸探针的数量。因此，本专利技术的方法比常用现有技术方法便宜得多，并且与选择性概况分析相容。本专利技术的方法的另一个优点是其顺利地适合当前的数字病理学工作流程。常见的数字病理学工作流程是：1.制备苏木精和伊红染料染色的载片，2.扫描苏木精和伊红染料载片以获得数字图像3.进行图像分析以达到病理学诊断(良性或恶性)，和4.同时鉴定ROIs用于进一步分子诊断，以提供更精确的诊断结果。专利技术概述本专利技术涉及用于空间检测组织样品中的核酸的方法，其包括以下步骤：鉴定样品内的至少一个目标区域(ROI)；将至少一种寡核苷酸探针应用于ROI内的预定义的位置上，且使所述寡核苷酸探针结合样品的核酸，其中所述寡核苷酸探针包含条形码序列；提取核酸-寡核苷酸探针复合物；将提取的核酸分子测序；将测序的核酸分子与ROI内相应的靶向的核酸分子的初始位置相关联，以产生靶向的核酸分子的空间分布，其中每个位置通过在步骤b)中结合的一种或多种寡核苷酸探针来鉴定。在一个实施方案中，在步骤d)之前经由DNA扩增从核酸-寡核苷酸探针复合物产生DNA分子。在另一个实施方案中，DNA分子的产生在逆转录反应之后发生。在一个实施方案中，步骤b)中的寡核苷酸探针与样品的核酸的结合经由杂交发生，其中所述寡核苷酸探针用作引物。在一个替代实施方案中，步骤b)中的寡核苷酸探针与样品的核酸的结合经由连接发生。在一个实施方案中，步骤e)还包括将靶向的核酸分子的空间分布与ROI的图像或在步骤b)之前或之后获得的鉴定了ROI的组织样品的图像相关联。在一个实施方案中，所述方法还包括提供二维空间图以显现靶向的核酸分子的空间分布。在一个实施方案中，所述方法还包括将二维空间图与ROI的图像或在步骤b)之前或之后获得的鉴定了ROI的组织样品的图像叠加。在一个实施方案中，将至少两个不同种类的寡核苷酸探针与步骤b)中的一种靶向的核酸分子结合，其中使用至少两个不同种类的寡核苷酸探针的独特组合来鉴定ROI内的靶向的核酸分子的位置。在一个实施方案中，结合一种核酸分子的至少一种寡核苷酸探针包含通用序列，其中任选地所述通用序列与所述靶向的核酸互补。在一个实施方案中，结合一种核酸分子的至少一种寡核苷酸探针包含额外序列，其中所述额外序列是纯化序列或引物比对序列。在一个实施方案中，所述预定义的位置通过分隔掩蔽物(separationmask)来定义。在一个实施方案中，所述分隔掩蔽物是任选地印刷在样品上的顶部分隔掩蔽物、或完全分隔掩蔽物，其中所述分隔掩蔽物是网格分隔掩蔽物、自由格式分隔掩蔽物或其组合。在一个实施方案中，通过液体转移技术，优选地通过接触印刷技术或非接触印刷技术，在步骤b)中将所述寡核苷酸探针应用至预定义的位置上，使得应用的寡核苷酸探针不在不同的预定义的位置之间混杂。在一个实施方案中，所述样品是组织病理学样本，优选脱石蜡的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品、新鲜冷冻(FF)样品或新鲜样品或细胞学样品。在一个实施方案中，所述靶向的核酸分子是RNA。在一个实施方案中，所述靶向的核酸分子是DNA。附图简述图1本专利技术的概述。(A)支持材料1和组织样品2以俯视图显示，并且以侧视图显示于小图中。(B)已将分隔掩蔽物应用至组织样品的顶部上，生成预定义的位置7。所描绘的分隔掩蔽物组合网格分隔掩蔽物3和自由格式分隔掩蔽物4。然而，也可以单独使用网格分隔掩蔽物和自由格式分隔掩蔽物4。具有不同横截面结构的两种类型的分隔掩蔽物显示于提供侧视图的小图中：(a)顶部分隔掩蔽物5，(b)完全分隔掩蔽物6。(C)将寡核苷酸探针已经在液相中应用至组织样品的预定义的位置上。小图提供侧视图：(a)顶部分隔掩蔽物5，(b)完全分隔掩蔽物6。图2(A)经由连接结合的寡核苷酸探针的示例性组成。显示了包含通用序列9、分别条形码本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于空间检测组织样品中的核酸的方法，其包括以下步骤：a) 鉴定样品内的至少一个目标区域(ROI)；b) 将至少一种寡核苷酸探针应用于ROI内的预定义的位置上，且使所述寡核苷酸探针结合样品的核酸，其中所述寡核苷酸探针包含条形码序列；c) 提取核酸‑寡核苷酸探针复合物；d) 将提取的核酸分子测序；e) 将测序的核酸分子与ROI内相应的靶向的核酸分子的初始位置相关联，以产生靶向的核酸分子的空间分布，其中每个位置通过在步骤b)中结合的一种或多种寡核苷酸探针来鉴定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.14 EP 15163481.31.用于空间检测组织样品中的核酸的方法，其包括以下步骤：a)鉴定样品内的至少一个目标区域(ROI)；b)将至少一种寡核苷酸探针应用于ROI内的预定义的位置上，且使所述寡核苷酸探针结合样品的核酸，其中所述寡核苷酸探针包含条形码序列；c)提取核酸-寡核苷酸探针复合物；d)将提取的核酸分子测序；e)将测序的核酸分子与ROI内相应的靶向的核酸分子的初始位置相关联，以产生靶向的核酸分子的空间分布，其中每个位置通过在步骤b)中结合的一种或多种寡核苷酸探针来鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤d)之前经由DNA扩增从所述核酸-寡核苷酸探针复合物产生DNA分子。3.根据权利要求2所述的方法，其中DNA分子的产生在逆转录反应之后发生。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在步骤b)中，所述寡核苷酸探针与所述样品的核酸的结合经由杂交发生，且其中所述寡核苷酸探针用作引物。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述寡核苷酸探针与所述样品的核酸的结合经由连接发生。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤e)还包括将靶向的核酸分子的空间分布与ROI的图像或在步骤b)之前或之后获得的鉴定了ROI的组织样品的图像相关联。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括提供二维空间图以显现所述靶向的核酸分子的空间分布。8.根据权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：M范德里伊，R维姆伯格弗里伊德，A皮尔里克，
申请(专利权)人：皇家飞利浦有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL