溶细胞性T细胞相关抗原4可溶性部分的重组基因，及其融合基因与产物制造技术

本发明专利技术提供了一种重组ｓＣＴＬＡ－４基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性。本发明专利技术还提供一种包含该重组基因的融合基因。当本发明专利技术的基因或融基因表达时，其在ＣＨＯ等哺乳动物细胞中的表达量及其淋巴细胞抑制能力均显著提高。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA-4)尤其是其可溶性部分的重组基因，以及含该重组基因的融合基因及其产物。
技术介绍
溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA-4)是表达在活化T细胞表面的标志性分子之一。研究表明，该成分是维持体内T细胞稳定性的负调控因子，具有抑制活化T-细胞的增值的功能，与CD28构成了一对十分重要的免疫调节因子。目前，它被作为免疫抑制受体进行了广泛的研究，在临床上有可能作为抑制免疫排斥反应的制剂进行应用。CTLA-4是一种极性跨膜蛋白。将这种蛋白的膜外可溶性部分(sCTLA-4)的基因与抗体分子Fc片段的编码融合在一起构成融合基因，插入适当的载体，导入适当的细胞后可以表达得到一种天然不存在的融合蛋白，它既有细胞表面受体与其原有配体结合的能力，又有抗体分子一样的可溶性，半衰期和抗体分子接近，保持活性时间比较长。利用人源基因获得的蛋白分子在体内不会引起免疫反应。目前已经有多种类似的可溶性融合蛋白质被制备出来并成功地用于临床。专利技术目的本专利技术的目的在于提供一种重组的sCTLA-4基因，它能够提高在哺乳动物细胞内的表达。本专利技术的目的还在于提供一种含有该重组基因的融合基因，以及由此得到的融合蛋白，该融合蛋白具有更强的免疫活性。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组载体的哺乳动物细胞。技术方案为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种新的重组sCTLA-4基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，所述重组基因的序列为SEQ IDNO.1gctatgcagg tcgcgcaccc agccgtagtt ctcgcgagga ggcgtggaat ggcaagttta60gtctgagact aagcttcccc tggaaaggca acggacgtgc gagtcactgt cctacgccat 120gcagagaggc acgtcacaga ggtgtgagcc gctacgtaga tgaccggaaa ggacttcacg 180ttgctcgaag agtcgatatg gaccggaaca tcgagaggta agcaagtcaa gctgacaatt 240catggtctca gcgcgatgga gaccggtctg tagatgtgga acgtcgacct gatgtagcct 300ccaccttagt agctcggaat cggaaagggt acgcacatat acgtcataga acctgatccc 360tggcctgaat cagagttgct gctgtgcata ctagctgctg taagatccgg cttcttatta 420taaaggttgc tactgactgc agtatcattc aggaatatgc ttaacaatag taggccacta 480actactggcg tgtaagtcaa tatgcctccg actgaccctg attgagataa ccatttccat 540ccataattaa tcccaatgaa ttga 564为了克隆与表达的目的，本专利技术在该序列在该结构基因前增加了一段操作序列CATgctagcATG。其中，前3个大写碱基表示的保护碱基，下划线部分是NheI酶切位点，其后是加入的起始密码子ATG。本专利技术还提供了包含该重组基因的融合基因。其中，重组sCTLA-4基因与人Ig抗体Fc片段的融合。在本专利技术的一种优选实施方式中，重组sCTLA-4基因通过一段接头序列与人Ig抗体Fc片段融合，其编码的氨基酸序列为(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO2)。该氨基酸序列的DNA序列之一为5’-ACCACAACCT CGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCTCGTCAACCAC AACCTCGTCA ACCACAACCT CGTCA-3’(SEQ ID NO3)。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。所述的载体可以是本领域熟知的各种适合转染哺乳动物的表达载体。本专利技术的目的还在于提供含有本专利技术重组载体的哺乳动物细胞。所述的哺乳动物细胞可以是例如CHO细胞，Hela细胞，小鼠Ltk-(4)细胞，猴肾VERO细胞等各种常用哺乳动物工程细胞株。专利技术效果本专利技术在构建人CTLA-4可溶部分(sCTLA-4)与人Ig抗体Fc片段的融合基因时，通过人工重新设计sCTLA4基因及其与Fc片段之间的接头序列，使该融合蛋白的免疫活性及其在CHO等哺乳动物细胞中的表达量得到了显著提高。优选实施方式实施例1全长重组sCTLA-4基因的制备全长重组sCTLA-4基因(sCTLA4-M)的合成本专利技术根据哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，已知sCTLA-4片段的氨基酸序列，设计了一段带有克隆表达操作序列的新的重组sCTLA-4基因(SEQ IDNO1)CATgctagcATGgctatgcagg tcgcgcaccc agccgtagtt ctcgcgagga ggcgtggaat ggcaagttta 60gtctgagact aagcttcccc tggaaaggca acggacgtgc gagtcactgt cctacgccat 120gcagagaggc acgtcacaga ggtgtgagcc gctacgtaga tgaccggaaa ggacttcacg 180ttgctcgaag agtcgatatg gaccggaaca tcgagaggta agcaagtcaa gctgacaatt 240catggtctca gcgcgatgga gaccggtctg tagatgtgga acgtcgacct gatgtagcct 300ccaccttagt agctcggaat cggaaagggt acgcacatat acgtcataga acctgatccc 360tggcctgaat cagagttgct gctgtgcata ctagctgctg taagatccgg cttcttatta 420taaaggttgc tactgactgc agtatcattc aggaatatgc ttaacaatag taggccacta 480actactggcg tgtaagtcaa tatgcctccg actgaccctg attgagataa ccatttccat 540ccataattaa tcccaatgaa ttga 564运用GCG软件将上述序列及其互补序列分解成长约85b的片段，共计25个多核苷酸片段，其中正链的的第一个片段为5’-CAGgctagcATGgctatgcaggtcgcgcacccagccgtagttctcgcgaggaggcgtgga -3’(SEQ IDNO4)，其前三位碱基是保护碱基，第4-9个碱基是向表达载体插入时的酶切位点(Nhe I)，第一个ATG是加入的起始密码子。该片段也是合成全长融合基因时的上游引物，本研究中记作sCTLA4-M5′。设计原则是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组ｓＣＴＬＡ－４基因，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高虹，胡辉，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]