一种调控非复制型腺病毒复制的方法技术

本发明专利技术属生物医学领域，涉及一种组合式腺病毒肿瘤基因治疗方法，具体涉及一种复制型腺病毒调控非复制型腺病毒复制的方法。本发明专利技术利用能够高度选择性地在肿瘤细胞内复制的腺病毒与携带各种治疗基因的非复制型腺病毒相结合，进行肿瘤基因治疗。本发明专利技术能够有效利用两种病毒的优点，克服各自的弱点，使建立在腺病毒基础上的肿瘤基因治疗更灵活和更有靶向性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物医学领域，涉及一种组合式腺病毒肿瘤基因治疗方法，具体涉及一种复制型腺病毒调控非复制型腺病毒复制的方法。近年来科学家在肿瘤细胞生物学和分子生物学研究方面所取得的进展与成就为建立新的肿瘤基因治疗方法奠定了基础。基因治疗被认为是很有希望的新方法，其最大的优势在于利用正常与肿瘤细胞间在分子水平方面的差异，可以有效地、选择性地攻击肿瘤细胞，拓宽了肿瘤的“治疗窗”，在增强治疗效果的同时减少副作用。不过，现有的各种基因治疗方法在临床应用方面仍然面临着许多困难和障碍。其中最关键的问.题是缺乏针对肿瘤细胞的、高效的基因传递载体或系统。已有研究设计高特异性的、并能够高效地在肿瘤细胞复制的腺病毒载体设计方法以及建立在其基础上的肿瘤基因治疗新方法。这种方法使腺病毒能够选择性地在肿瘤中复制，并能够携带和表达各种治疗基因，从而达到有效治疗肿瘤而无副作用的目的。腺病毒是一种毒性较小的感冒病毒，对人体危害不大。它的最突出的优点，是能够以非常高的效率感染各种人类细胞。重组腺病毒是目前世界各国肿瘤基因治疗研究人员的首选基因导入工具。在过去15年的研究中，主要从生物安全性的角度出发，人们均采用复制缺陷型腺病毒作为基因传递的载体。但是，在实际应用中发现复制缺陷型腺病毒传递基因的效率和治疗效果仍然不理想。有文献报道肿瘤局部注射复制缺陷型腺病毒，即使在最优化的状态下也仅仅只有10-15％的病毒能感染肿瘤细胞。因此，应用复制缺陷型腺病毒作肿瘤基因治疗，不仅要求病毒用量很大，而且并非所有的肿瘤细胞均能被同时感染，故难以达到治疗目的。采用具有“旁观者效应”的治疗基因，可以改善或增强治疗效果，但仍然不能完全克服复制缺陷型病毒固有的弱点。随着非复制型腺病毒的大量应用，人们对腺病毒在人体内的分布特点和安全性有了更深入的了解和认识。为了提高治疗基因在肿瘤局部的传递效率和表达水平，研究人员开始使用具有复制能力的腺病毒作为基因传递载体。采用复制型腺病毒必须解决的关键问题是使病毒的复制严格限制在肿瘤细胞内。目前，为了获得肿瘤特异性的复制已有许多不同的方案或策略。典型实例如onyx-015病毒，它能够选择性地在p53基因功能已丧失的肿瘤细胞内复制。由于50％以上的肿瘤均有p53基因失活，理论上讲onyx-015病毒可用于治疗一半以上的肿瘤。不过，目前对onyx015病毒肿瘤特异性问题存在争议，有人观察到onyx-015病毒在p53基因完整的肿瘤细胞内也有复制。另一个典型的例子是CN706病毒，该病毒利用前列腺特异抗原(PSA)基因启动子驱使E1A基因表达，这一病毒已被证实具有前列腺细胞选择毒性。早期的复制型病毒杀伤肿瘤的主要机制，在于通过病毒在肿瘤细胞中大量繁殖，使宿主细胞裂解，但是，在许多体内实验的结果并不理想。因此，研究人员尝试在复制型病毒内加入各种各样的治疗基因，以加强其治疗效果。使病毒既可以通过复制裂解细胞，也可以通过各种治疗基因杀死肿瘤细胞，而不是只通过裂解这一单一机制。然而，要在复制型病毒里插入治疗基因有障碍。主要的障碍在于复制型病毒携带外源性基因的能力极为有限，因为复制型腺病毒的基因组内加入了与腺病毒复制有关的E1A或E1B或E4基因，其容纳外源DNA的能力大大下降，通常只有2kb。这样，只有较小的基因才能被插入到病毒里，使治疗基因的选择受到较大的限制。本专利技术具有以下优点1)简化了复制型腺病毒的构建。无需针对每一种肿瘤治疗基因单独构建相应的组织特异性复制型腺病毒。2)可以继续使用原经过实践证实有效的各种非复制型腺病毒。3)可以任意地组合多种病毒和治疗基因，方便且灵活。本专利技术方法的最终目的，是最大限度地发挥抗肿瘤效果并同时尽可能减少毒、副作用，真正实现个体化的肿瘤基因治疗方案。它的核心在于利用复制型腺病毒调控并带动非复制型腺病毒进行复制，使以复制型腺病毒为基础的肿瘤基因治疗方法更加灵活和特异。通过以下步骤构建肿瘤特异性复制型腺病毒。A.分离肿瘤特异性启动子。A1.端粒酶5’端调控顺序在自然的DNA复制过程中，染色体的末端将随着每一次细胞分裂而缩短。位于染色体末端的一个特殊结构称为端粒。端粒的完整对染色体的稳定性至关重要。而端粒的完整是靠端粒酶来维持的。端粒酶在超过99％的正常细胞里没有活性，而在超过90％的肿瘤细胞里被重新激活。实验证明，端粒酶活性是由它的启动子控制的。因此，端粒酶(TERT)的启动子就成为有效调控目的基因仅在肿瘤里表达、而在正常细胞里不表达的一个启动子。本专利技术通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增启动子序列一，把它插入质粒pEGFP-1(购自Clontech公司)中，构建了pTERT-EGFP表达质粒。利用脂质体把pTERT-EGFP转入到各种肿瘤细胞中，可以观察到EGFP仅在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中则不表达。A2.E2F1基因启动子在绝大多数的肿瘤细胞中，抑癌基因Rb及其相关的信号通路上的其它基因都处于失活状态。这些变化使转录因子E2F1得以激活。因此，E2F1基因的启动子在大多数的肿瘤中都处于活化状态，而在大多数的正常细胞中却没有活性。因此，可以通过E2F1基因的启动子控制腺病毒的复制，使腺病毒的复制局限在肿瘤细胞中。本专利技术通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子序列二，把这段顺序克隆入pEGFP-1中，得到质粒pE2F1-EGFP。利用脂质体将该质粒导入细胞中。实验结果表明，EGFP主要在肿瘤细胞中表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明所得启动子有较高的肿瘤细胞特异性。A3.缺氧诱导性启动子。氧气分压降低已被确定为各种实体肿瘤的统一特征。其产生的主要原因是由于肿瘤细胞快速生长，而新生血管的生长速度跟不上肿瘤。因此，肿瘤组织内的各种营养成分，如氧气、葡萄糖等都处于长期或间歇性的短缺状态。处于这种微环境状况下的肿瘤细胞，会激活一系列的基因的表达。而这些基因的激活都由缺氧诱导因子(HIF-1α)的转录因子调控。其激活机制，主要是通过其下游基因的5’端调控顺序中的所谓缺氧反应单元(HRE)。这一单元的存在，使这些基因具有在缺氧状况下被激活的特点。而这些基因在绝大多数的正常细胞中，都处于低表达状态。这样，缺氧诱导性基因的启动子主要在肿瘤细胞内选择性激活。本专利技术通过PCR技术，分离缺氧诱导性的启动子，以人类细胞DNA为模板，扩增出血管通透性因子(VEGF)的5’的启动子序列三。实验证明，所述血管通透性因子是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。它的启动子，也被证实在肿瘤中选择性地被激活。本专利技术把上述顺序克隆到质粒pEGFP-1中，得到pHRP-EGFP-1。在随后的实验中证明，所述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被选择性激活，在正常氧气分压下活性很低。B.构建肿瘤特异性的复制型腺病毒载体通过本领域常规基因工程技术将上述分离到的启动子嵌入腺病毒的DNA中，构建下述腺病毒载体，使之控制早期基因E1A的表达，如附图说明图1所示。1)AdHRP-E1a-dsRed2，其E1a基因由缺氧诱导性因子启动子HRP控制。2)AdTERT-E1a-dsRed2，其E1a基因由端粒酶基因启动子TERT控制。3)AdE2F1-E1a-dsRed2，其E1a基因由E2F1基因启动子控制。上述病毒载体的基因组中加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控非复制型腺病毒复制的方法，其特征是用复制型病毒调控并带动非复制型病毒复制。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李川源，黄倩，
申请(专利权)人：李川源，黄倩，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]