本发明专利技术公开了一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，包括真核表达载体，所述真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb?Numblike表达的序列。这种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，通过抑制Numb和Numblike的mRNA的转录，以明显降低Numb和Numblike的蛋白表达量。该稳定表达细胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞Numb和Numblike的表达状态为研究Numb和Numblike在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为Numb和Numblike的功能的研究提供了帮助。本发明专利技术还提供一种上述定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法。
【技术实现步骤摘要】
稳定敲低Numb和Numbl ike的细胞系及其构建方法
本专利技术涉及细胞学领域,尤其涉及一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法。
技术介绍
Numb是第一个被发现决定多细胞生物不对称细胞分裂的信号蛋白。在果蝇中，Numb通过促进Notch泛素化拮抗Notch信号通路,从而决定子细胞的命运。后来的研究表明Numb是细胞内吞调节蛋白，并用通过内吞参与调节神经细胞的粘附，轴突的生长及细胞迁移等过程。然而，Numb可能还有一些附加功能，以证明Numb被认为在乳腺癌细胞中是肿瘤抑制剂。在乳腺癌细胞中常表现Numb低表达，而研究表明在主要的乳腺癌细胞中Numb低表达导致了 P53水平的降低并升高了药物抗性，同时这种Numb的低表达也提高了 Notch受体的活性。因此，在这一类癌症中，Numb低表达这一单独的事件就决定了一个致癌基因(Notch)的激活和p53肿瘤抑制通路的衰减。后来研究发现Numb与肿瘤抑制基因p53、泛素化蛋白HDM2形成三聚体抑制p53的泛素化，从而调节肿瘤的恶性程度。Numb的抑癌作用还不止于。研究表明，小脑颗粒细胞前体细胞(granulecellprogenitors, GCPs)来源的肿瘤细胞中的Numb水平是下调的。进一步的研究表明,Numb通过Itch依赖的泛素化,调控Hedgehog的转录因子Glil的降解,从而抑制Hedgehog信号通路，而这一调控机制的失去平衡将成为肿瘤发生的诱因之一。Numb既可以拮抗Notch信号，又可以维持p53的稳定性,还可以抑制Hedgehog信号通路，是一个潜在的抑癌分子。d-Numb在脊椎动物中有两个同源基因Numb基因和Numblike基因，Numblike基因的C端序列与Numb基因也有46.7%的同源性，这表明Numb基因与Numblike基因在功能上有一定的重叠性但又不完全相同。在发育中的新皮质，Numb在从VZ区到CP(corticalplate)的各层都有表达，而Numblike则主要表达在CP层。在神经发生的早期，几乎所有CNS发育的区域,Numb和Numblike可能对于维持神经前体细胞的命运都是必须的。Numb和Numblike对于维持神经上皮结构的完整性是必需的,Numb对于(感觉)神经的形态发育也是必需的。在感觉神经中,Numb和Numblike有可能通过内吞体-溶酶体途径,控制Notchl是进入早期内吞体抑或晚期内吞体，来实现对Notchl的精细调控，并由此影响感觉神经元轴突等。Numb和Numblike共同发挥着许多重要的作用，Numb和Numblike共同低表达在模拟体内乳腺癌细胞蛋白表达状态上更加合理。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法。—种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,包括真核表达载体,所述真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列。在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID N0.1所不的核苷酸序列。在一个实施例中，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列为SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列。 在一个实施例中，所述细胞系为MCF-10A细胞系。在一个实施例中，所述真核表达载体为pGIPZ质粒。在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的shRNA插入区。在一个实施例中,所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的Xba I位点。—种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法,括如下步骤:构建包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，同时制备U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列；将所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列酶切后连接到所述包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体,得到包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体；将所述包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到所述稳定敲低Numb和Numblike的细胞系。在一个实施例中，所述真核表达载体为pGIPZ质粒。在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的shRNA插入区，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的Xba I位点。这种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，通过抑制Numb和Numblike的mRNA的转录，以明显降低Numb和Numblike的蛋白表达量。该稳定表达细胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞Numb和Numblike的表达状态为研究Numb和Numblike在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为Numb和Numblike的功能的研究提供了帮助。【专利附图】【附图说明】图1为原始的pGIPZ质粒的图谱；图2为一实施方式的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法；图3为用293T细胞在pH为7.07的情况下感染病毒24h和48h的荧光图；图4为用AD293细胞在pH为7.07的情况下感染病毒24h和48h的荧光图；图5为培养基中不同浓度的Puromycin的选择的筛选结果图；图6为Q-PCR结果示意图；图7为Numb和Numblike的蛋白表达电泳图。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。—实施方式的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,包括真核表达载体。 真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、U6promoter和用于抑制NumbNumblike表达的序列。用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。U6启动子(U6promoter)和用于抑制Numb Numblike表达的序列为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。细胞系可以为MCF-10A细胞系，其原始来源为人乳腺细胞，购买自美国菌种保藏中心(ATCC)。真核表达载体可以为pGIPZ质粒。如图1所示，具体来说，用于抑制Numb表达的序列插入在pGIPZ质粒的shRNA插入区，U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入在pGIPZ质粒的Xba I位点。如图2所示的上述稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,包括如下步骤。S10、构建包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，同时制备U6promoter和用于抑制Numb Numblike表达的序列。本实施方式中，直接从Open Biosystems公司购入包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体(pGIPZ本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,包括真核表达载体,所述真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列。2.如权利要求1所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述细胞系为MCF-1OA细胞系。5.如权利要求1所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述真核表达载体为PGIPZ质粒。6.如权利要求5所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的shRNA插入区。7.如权利要求5所述的稳定敲低Numb和Numblike的细胞系,其特征在于,所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入到所述p...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵喜明，杨诗涵，李红昌，李华顺，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。