利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用。本发明专利技术的用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间。利用本发明专利技术的系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的技术体系，无脱靶效应，为在水稻和其它作物中利用此系统进行基因的定点修饰提供了依据，为改良其它重要农作物的农艺性状提供基础。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
本专利技术涉及基因工程领域中利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用。
技术介绍
CRISPR/Cas9系统是继ZFNs和TALENs技术之后出现的基因组定点编辑新技术。与ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点；另外CRISPR/Cas9系统可同时对同一基因的不同位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活；此外，CRISPR/Cas9系统操作简单快捷，每次打靶只需替换原有载体上20-30bp的核苷酸序列，更适宜规模化，高通量操作。CRISPR/Cas9作为一种新的靶向基因修饰技术，展现了广阔的发展潜力和应用前景，有望成为未来基因定向编辑的最强有力的工具之一。目前已经应用于水稻、小麦、拟南芥以及本生烟基因组的定点敲除研究中，但尚未有进行重要农作物目标农艺性状通过定点修饰(氨基酸替换或定点整合)进行遗传改良的研究。利用CRISRP/Cas9系统在作物中对基因组编辑主要分为三种，基因的定点敲除方法获得突变体、对靶标基因的定点修饰及外源基因定点整合。因定点敲除操作方便，技术成熟等特点，在现有报道中最多。Shan等(2013)成功获得水稻OsBADH2、OsPDS基因突变体，突变概率为7.1％-9.4％。Wang等(2013)利用CRISPR技术成功定点敲除小麦TaMLO-A1基因。Miao等(2013)对水稻叶绿素合成基因CAO1和分蘖夹角控制基因LAZY进行编辑，结果表明，有83.3％的T0代转基因植株中CAO1基因相应位点发生了突变，而有高达91.6％的转基因植株中LAZY基因相应位点发生了突变，其中LAZY基因的突变纯合体的比例达到50％，均表现出分蘖夹角变大的表型。Zhang等(2014)对2个水稻亚种(粳稻日本晴和籼稻Kasalath)11个靶基因中CRISPR/Cas9诱导产生突变的效率、特点、遗传性及特异性等进行分析，T0代转基因植株突变效率高达66.7％，而且超过一半的靶基因位点在T0代获得纯合突变体，突变体后代的遗传传递符合经典的孟德尔定律。Ma等(2015)利用CRISPR/Cas9系统共编辑水稻中46个靶位点，突变率平均为85.4％，大部分为均一的双等位突变(54.9％)和纯合突变(24.7％)，并可遗传到后代。以上研究说明，利用CRISPR/Cas9系统可实现对作物特定基因的高效定点突变。利用CRISRP/Cas9系统对植物进行定点氨基酸替换和外源基因定点整合的研究，目前只有几例报道。Miao等(2013)通过将GUUS基因与CRISPR/Cas9系统同时转入到水稻中，可检测到GUS活性，说明同源重组发生。Schiml等(2014)将CRISPR/Cas9以及两端含有与spacer相同序列的模板DNA构建到同一个T-DNA中转化拟南芥，通过同源重组DNA修复途径，在AtADH1基因的靶标位点精确插入卡那霉素的抗性基因nptII。Li等(2015)将外源片段和CRISPR/Cas9同时导入大豆中，并在愈伤组织中检测到成功定点修饰的ALS1基因，但尚未获得植株。但将抗潮霉素基因表达盒与CRISPR/Cas9系统同时导入到大豆中，通过PCR及Southern鉴定确定获得同源重组株系，整合基因的遗传符合孟德尔遗传规律。Svitashev等(2015)通过同源重组方法将liguleless-1基因定点重组到玉米基因组中。此外，将CRISPR/Cas9系统和外源修饰片段(双链和单链DNA)同时通过基因枪或农杆菌方法导入玉米中，成功将ALS2的第165位的脯氨酸修饰为丝氨酸(P165S)的植株并获得磺脲类除草剂抗性。通过基因组编辑介导的同源重组，定点修饰提高重要农作物的除草剂抗性，是目前基因组编辑研究领域的热点之一。传统获得抗除草剂作物方法主要是(1)通过外源基因导入(epsps，bar，pmi等)提高农作物的除草剂抗性，已经有多项报道，但因为是属于转基因作物，其在重要粮食作物中的推广应用受到限制，目前尚未有抗除草剂的转基因小麦和水稻商业化生产的报道。此外，抗除草剂基因漂移可能形成超级杂草等转基因生物安全问题而备受关注。(2)植物氨基酸合成中的关键酶一直是新型除草剂研发中重要的靶标酶。通过EMS将作物内源基因突变，提高重要农作物的除草剂抗性，已经在小麦、大麦和水稻等有相关报道。但因EMS突变的随机性，需要大面积广泛筛选具有除草剂抗性和其它农艺性状未改变的突变体，因此，此技术很难得到广泛应用。靶标乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制剂类除草剂双草醚是目前开发最活跃的领域之一。乙酰乳酸合成酶(Acetolactatesynthase,ALS)存在于植物中，它能催化丙酮酸为乙酰乳酸，具有高度专一性和极高的催化效率，从而合成植物体内3种必需的支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)。磺脲类、咪唑啉酮类、嘧啶羧酸类除草剂可抑制ALS活性，破坏植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成，从而导致植物死亡。Swanson等(1989)利用小孢子化学诱变的方法获得2个抗咪唑啉酮类除草剂的油菜突变体PMl和PM2，PMl和PM2都由ALS基因点突变而成，其中PMl是基因BnALS1的第653位丝氨酸发生突变，PM2是基因BnALS2的第574位色氨酸发生突变(以拟南芥的ALS氨基酸位置计算)(Hattorietal.1995)。2014年3月，CibusGlobal公司利用单核苷酸基因修复技术(GeneRepairOligoNucleotidetechnology)，成功获得了ALS基因编辑后抗磺脲类除草剂油菜，目前已经在加拿大获得商业化生产(http://www.cibus.com/technology.php)。磺脲类、咪唑啉酮类、嘧啶羧酸类除草剂广泛应用于生产中，具备生物活性高、杀草谱广的优点，并且对人和动物具有安全性(Endoetal.,2007)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何获得抗除草剂的水稻。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于植物基因组定点修饰的系统。本专利技术所提供的用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间；所述两个靶位点中位于上游的靶位点为上游靶位点，位于下游的靶位点为下游靶位点；所述供体DNA含有所述上游靶位点、所述下游靶位点和位于所述上游靶位点和所述下游靶位点之间的定点修饰片段；所述定点修饰片段为要替换所述待定点修饰片段的DNA片段。上述系统中，所述定点修饰可为氨基酸替换，外源基因定点整合或外源片段定点整合。上述系统中，所述供体DNA还含有用于和所述靶DNA进行同源重组的上游同源臂和下游同源臂本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间；所述两个靶位点中位于上游的靶位点为上游靶位点，位于下游的靶位点为下游靶位点；所述供体DNA含有所述上游靶位点、所述下游靶位点和位于所述上游靶位点和所述下游靶位点之间的定点修饰片段；所述定点修饰片段为要替换所述待定点修饰片段的DNA片段。

【技术特征摘要】
1.用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间；所述两个靶位点中位于上游的靶位点为上游靶位点，位于下游的靶位点为下游靶位点；所述供体DNA含有所述上游靶位点、所述下游靶位点和位于所述上游靶位点和所述下游靶位点之间的定点修饰片段；所述定点修饰片段为要替换所述待定点修饰片段的DNA片段。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述植物或所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。4.根据权利要求1-3中任一所述的系统，其特征在于：所述靶DNA为编码乙酰乳酸合成酶的基因；所述乙酰乳酸合成酶为a1或a2的蛋白质：a1、氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质；a2、在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰乳酸合成酶活性的由a1衍生的蛋白质。5.根据权利要求1-4中任一所述的系统，其特征在于：所述上游靶位点为SEQIDNo.1的第7590-7609位所示的DNA片段；所述下游靶位点为SEQIDNo.1的第8032-8051位所示的DNA片段；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，孙永伟，赵云德，马有志，吴传银，张欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11