具有L‑色氨酸生产活性的埃希氏菌属微生物和使用其生产L‑色氨酸的方法技术

本申请涉及生产L‑色氨酸的埃希氏菌属微生物，更具体地，涉及通过使内源性6‑磷酸葡萄糖酸脱水酶和2‑酮‑3‑脱氧‑6‑磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性减弱或失活具有改进的生产L‑色氨酸活性的埃希氏菌属微生物。此外，本申请涉及使用埃希氏菌属微生物生产L‑色氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物和使用该微生物生产L-色氨酸的方法。
技术介绍
作为必需氨基酸的L-色氨酸被广泛用作饲料添加剂等，并且同样被广泛用作药物产品如输注溶液(infusionsolution)和保健食品成分的原料。可以通过化学合成法、酶反应法、发酵法等生产L-色氨酸，但目前主要使用利用微生物的直接发酵法。关于L-色氨酸生产菌株的研发方向，最初是通过选择突变(韩国专利号1987-0001813)、或通过经生物合成途径中的酶以及基因工程克服色氨酸反馈抑制的方法、或通过增强代谢过程中的酶合成——诸如增强色氨酸生物合成酶的表达来进行研发。同时，先前公开了利用恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径提高L-氨基酸的方法(美国专利号7432085)。美国专利号7432085涉及通过增强恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及酶的活性来提高由利用丙酮酸作为中间体的生物合成途径产生的L-氨基酸的生产的方法，并且具体地，该专利的关键特征是增强6-磷酸葡萄糖酸脱水酶或2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性。然而，本专利技术人首次证实：就L-色氨酸而言(不像其它L-氨基酸)，当恩特纳-杜德洛夫途径中的6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活性均减弱或失活时，可以显著提高生产L-色氨酸的能力，从而完成本专利技术——关于具有提高的生产L-色氨酸能力的埃希氏菌属微生物和使用该微生物生产L-色氨酸的方法。公开内容技术问题本申请的目的是提供生产L-色氨酸的微生物。本申请的另一目的是提供使用生产L-色氨酸的微生物有效生产L-色氨酸的方法。技术方案为了实现上述目的，一方面，本申请提供了通过使内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(eda)的活性减弱或失活来生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物。如本文所使用的，术语“L-色氨酸”是指芳香族L-氨基酸，其为不在体内合成的α-氨基酸和必需氨基酸，化学式为C11H12N2O2。如本文所使用的，术语“恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径”是指存在于埃希氏菌属微生物中的碳代谢途径，其是通过6-磷酸葡萄糖酸脱水酶和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶经连续两步酶反应催化引入碳代谢途径的碳源转化为甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸酯的途径。如本文所使用的，术语“6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd；EC4.2.1.12)”是指恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及的酶，其催化将6-磷酸-D-葡萄糖酸酯转化为2-二氢-3-脱氧-6-磷酸-D-葡萄糖酸酯的反应。具体地，该酶可具有SEQIDNO：1的氨基酸序列，但是可无限制地包括具有该酶活性的任何序列。此外，在示例性实施方式中，编码6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的基因可以由SEQIDNO：2的核苷酸序列表示，但是可无限制地包括编码该酶的任何序列。如本文所使用的，术语“2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda；EC4.1.2.14)”是指恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径中所涉及的酶，其催化将2-二氢-3-脱氧-6-磷酸-D-葡萄糖酸酯转化为甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸酯的反应。具体地，该酶可具有SEQIDNO：3的氨基酸序列，但是可无限制地包括具有该酶活性的任何序列。此外，在示例性实施方式中，编码2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因可以由SEQIDNO：4的核苷酸序列表示，但是可无限制地包括编码该酶的任何序列。除了由SEQIDNO：1至3表示的氨基酸序列之外，上述每种酶可无限制地包括与上面所列氨基酸序列的每一个具有70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、又甚至更具体地98％或更高、又甚至还更具体地99％或更高同源性的任何氨基酸序列，只要该酶呈现与每种酶基本上相同或相应的效果。此外，显而易见地，具有上述同源性的以及具有与每种酶相应的效果的任何修饰酶可以属于本申请的范围，尽管该酶可具有部分缺失、修饰、替代或添加的氨基酸序列。此外，除了由SEQIDNO：2或4表示的核苷酸序列之外，编码每种酶的基因也可无限制地包括编码所述酶的任何基因序列——其与上面所列核苷酸序列的每个具有80％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地98％或更高、又甚至更具体地99％或更高的同源性，只要该序列编码具有与每种酶基本上相同或相应效果的酶。此外，显而易见地，具有以上同源性的任何核苷酸序列可以属于本申请的范围，尽管该序列可在其中具有部分缺失、修饰、替代或添加。如本文所使用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。可以通过本领域已知技术确定一个部分与另一个部分的序列对应。例如，可以通过使用容易获得并能够比对序列信息的计算机程序(例如，BLAST2.0)直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子上的序列信息(例如，诸如打分、同一性和相似性的参数)来确定同源性。此外，可以通过在同源区域中形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，然后通过单链特异性核酸酶使杂交链消化以确定消化片段的大小来确定同源性。如本文所使用的，术语“内源活性”是指天然状态下或修饰之前的微生物中的酶的活性状态。如本文所使用的，术语“使酶活性与其内源活性相比减弱”是指这样的概念，其包括微生物中的酶活性与其在天然状态下或修饰之前原始具有的酶活性相比存在降低的情况、总蛋白质表达水平低于野生型菌株或微生物修饰前的菌株的总蛋白质表达水平——由于编码其的基因的表达抑制或翻译抑制——的情况、或其组合情况。如本文所使用的，术语“失活”是指编码微生物中的酶的基因完全不表达的情况，和与野生型菌株或微生物修饰前的菌株相比，基因被表达但不呈现活性的情况。酶活性的减弱或失活可通过本领域熟知的多种方法实现。方法的实例可包括将在染色体上编码酶的基因用经突变以使酶活性可以降低(包括酶活性被消除的情况)的基因替代的方法；将修饰引入到染色体上编码酶的基因的表达控制序列中的方法；将编码酶的基因的表达控制序列用具有弱活性或不具有活性的序列替代的方法；使染色体上编码酶的基因的部分或全部缺失的方法；引入反义寡核苷酸(如反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸通过与染色体上基因的转录物互补结合来抑制mRNA翻译成酶；通过在编码酶的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列的前端上人工添加SD序列及其互补序列来形成二级结构而使核糖体不能附着的方法；反转录工程(RTE)——其在对应序列的开放阅读框(ORF)的3′末端添加将被反转录的启动子——的方法等，；并且也可包括其组合，但并不限于此。具体地，使编码酶的部分或全部基因缺失的方法可以通过使用细菌中的染色体插入的载体将染色体中编码内源性靶蛋白的多核苷酸用具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因替代来进行。在使基因的部分或全部缺失的方法的示例性实施方式中，可以通过同源重组使基因缺失。如本文所使用的，术语“部分”(尽管其可以根据多核苷酸的种类而变化)具体地可以指1个核苷酸至300个核苷酸、更具体地1个核苷酸至100个核苷酸、和甚至更具体地1个核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产L‑色氨酸的埃希氏菌属微生物，其中内源性6‑磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2‑酮‑3‑脱氧‑6‑磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性被减弱或失活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.23 KR 10-2014-00766981.生产L-色氨酸的埃希氏菌属微生物，其中内源性6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)的活性被减弱或失活。2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述6-磷酸葡萄糖酸脱水酶具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的微生物，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁起龙，金径林，李锡明，李光镐，李根喆，洪亨杓，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR