制备包含真皮和表皮的三维培养皮肤的方法及由其制造的培养皮肤技术

本发明专利技术涉及一种制造包含真皮和表皮的三维培养皮肤模型的方法，其包括：使用包含鼠成纤维细胞、天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物制备真皮的步骤；以及使用角蛋白细胞形成表皮的步骤。此外，本发明专利技术涉及一种三维培养皮肤模型，其包括：通过包含鼠成纤维细胞、天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物制成的真皮；和由角蛋白细胞形成的表皮。本发明专利技术的三维培养皮肤模型可以广泛用于药物或化妆品的毒性和功效实验，以及用于动物实验的替代实验领域，因为通过使用鼠3T3细胞用于制造皮肤模型以及使用去端肽胶原和天然胶原的混合物，使得三维培养皮肤模型在真皮和表皮的形成和分化方面优异，并且通过抑制真皮的胶原收缩和降解现象而具有类似于天然皮肤层的结构。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备包含真皮和表皮的三维培养皮肤模型的方法，并包含用鼠成纤维细胞和单独的天然胶原或者天然胶原与去端肽胶原的组合制备真皮的步骤、以及使用角质化细胞形成表皮的步骤。本专利技术还涉及一种三维培养皮肤模型，其由使用含有鼠成纤维细胞和单独的天然胶原或者天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物制备的真皮以及由角质化细胞形成的表皮组成。
技术介绍
人类皮肤是覆盖整个身体表面的最大的器官。皮肤具有包括温度控制、防止外部环境等的各种功能，并且在成人中具有约1.2m2至约2.3m2的表面积。皮肤由表皮和真皮组成。真皮由胶原和成纤维细胞组成，并且表皮由角质化细胞、黑素细胞等组成。与具有相对恒定厚度的表皮不同，已知真皮的厚度根据面积变化很大，并且还比表皮厚约3倍。表皮分层为基底膜、棘层、颗粒层和角质层的亚层，并且许多层最终分化的死细胞积聚在皮肤表面上以起到保护作用。基底膜为薄膜的形式，其中层粘连蛋白和几种细胞外基质沉积在4型胶原网格上，并且基底层的细胞附着于其上。皮肤损伤伴随基底膜的分解，并且允许基底层中的细胞与1型胶原接触，在此期间表皮细胞迁移到侧面，从而诱导表皮再生。真皮具有许多成纤维细胞并且由乳头状真皮(其中分布有微血管)和网状真皮(其中存在许多厚的胶原纤维)组成。毛囊和皮肤的各种辅助器官位于皮肤深处。因此，在表皮由于部分厚度伤口而损失的情况下，表皮细胞将从毛囊生长出来并诱导表皮再生。同时，已经尝试构成人造皮肤组织。人造皮肤能够通常用于替代已经失去其通过自身细胞再生的能力的损伤皮肤、皮肤溃疡、或者药物或化妆品等的毒性和功效实验。人造皮肤对于皮肤替代物以替换受损的人类皮肤或用于其治疗的药物、或作为用于与皮肤、日用品、化妆品等接触的医疗设备的毒性和功效测试的实验材料的开发非常重要。因此，为了该利用，需要开发具有模拟天然皮肤层的结构的人造皮肤。在欧洲，自2013年以来，通过动物实验制造的化妆品的销售已被完全禁止，并因此领先的全球化妆品公司正在对人造皮肤的开发进行大量投资。例如，由欧莱雅法国自行开发的已通过欧洲人造皮肤标准，被认为是完全取代动物实验的人造皮肤，由MatTek公司在美国开发的已经只获得了临时批准，因为它对人体皮肤表现出过度反应。迄今开发的用于制备人工培养的皮肤模型的代表性方法的实例可以包括：用于在去表皮的真皮(RE-DED)上制备重建表皮的方法，其中人角质化细胞在去除表皮的真皮上三维培养；和在含有成纤维细胞的胶原基质上培养人角质化细胞的活体皮肤等同物(LSE)的方法。然而，迄今为止开发的三维培养皮肤具有缺点，即在用胶原制备的真皮和表皮之间不完全地形成基底膜，并且在培养过程中发生真皮收缩。因此，仍然需要一种用于制备可以更接近地模拟人类皮肤的三维培养皮肤的技术。
技术实现思路
[技术问题]在这种情况下，本专利技术人努力开发类似于能够用于药物或化妆品的毒性和功效测试的人类皮肤层的三维培养皮肤。结果，他们已发现通过使用鼠3T3细胞和去端肽胶原与天然胶原的混合物可以克服真皮收缩，从而制备可以替代实验动物的三维培养皮肤模型，并从而完成本专利技术。[技术方案]本专利技术的目的为提供一种制备由真皮和表皮组成的三维培养皮肤模型的方法，其包括：将含有鼠成纤维细胞、和天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物接种到培养皿中并使其固化以制备真皮；将角质化细胞接种到上述步骤中制备的真皮的上层中并进行培养，直到在其上形成细胞片层；以及将在上述步骤中形成的细胞片层在空气中暴露以形成表皮。本专利技术的另一个目的为提供一种三维培养皮肤模型，其包括：通过使用包含鼠成纤维细胞和天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物制备的真皮；和由角质化细胞形成的表皮。[本专利技术的有利效果]本专利技术的三维培养皮肤模型可以广泛用于药物或化妆品的毒性和功效试验，以及用于动物实验的替代性试验领域中，因为三维培养皮肤模型通过使用鼠3T3细胞来制备皮肤模型以及去端肽胶原和天然胶原的混合物，显示出优异的真皮和表皮的形成和分化，并且还通过抑制真皮中的胶原的收缩和降解而具有类似于人类皮肤层的结构。附图说明图1表示三维培养皮肤模型的结构的图像，其中通过使用由苏木精&曙红(H&E)染色确认的人成纤维细胞(A)或鼠成纤维细胞3T3细胞(B)分别制备真皮。图2表示在通过使用人成纤维细胞(HF)或鼠成纤维细胞3T3细胞(MF)制备真皮的三维培养皮肤模型中确认表达基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的图像。图3表示在通过使用人成纤维细胞(HF)或鼠成纤维细胞3T3细胞(MF)制备真皮的三维培养皮肤模型中角质化细胞的成片层能力(达到融合的速率)的图像。在本专利技术中，融合是指培养表面完全被细胞覆盖的状态。图4表示通过H&E染色确认实验组1(其中通过仅使用去端肽胶原来制备真皮)、实验组2(其中通过仅使用天然胶原来制备真皮)和实验组3(其中通过以1:5的比例混合去端肽胶原与天然胶原来制备真皮)中的三维培养皮肤模型的结构的图像。胶原蛋白的收缩用表示。图5表示确认其中培养了实验组1(其中通过仅使用去端肽胶原来制备真皮)、实验组2(其中通过仅使用天然胶原来制备真皮)和实验组3(其中通过以1:5的比例混合去端肽胶原与天然胶原来制备真皮)的每个三维培养皮肤的培养基中MMP-2和MMP-9的表达的图。图6表示确认三维培养皮肤模型的结构的H&E染色图像，其中通过以1:1、1:5或1:10的比例混合去端肽胶原与天然胶原来制备真皮。图7表示确认三维培养皮肤模型的结构的H&E染色图像，其中当制备表皮时添加了黑素细胞。图8表示确认三维培养皮肤模型的结构的H&E染色图像，其中通过角膜上皮细胞(也称为来自角膜的角质化细胞)制备表皮。图9表示确认三维培养皮肤模型的结构的H&E染色图像，其中通过口腔粘膜角质化细胞制备表皮。具体实施方式为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种制备由真皮和表皮组成的三维培养皮肤模型的方法，其包括：通过使用含有天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物来制备真皮；并且通过使用角质化细胞来制备表皮。具体地，本专利技术提供了一种制备由真皮和表皮组成的三维培养皮肤模型的方法，其包括：(a)将含有鼠成纤维细胞、和天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物接种到培养皿中并使其固化以制备真皮；(b)将角质化细胞接种到上述步骤中制备的真皮上并培养直到融合；和(c)将其提升到空气/液体界面以形成表皮的上层。本专利技术的特征在于，在制备由真皮和表皮组成的三维培养皮肤模型的过程中，通过使用含有鼠成纤维细胞和天然胶原单独或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物制备真皮，因此，表皮的形成和分化被优化，并且真皮收缩被抑制，从而产生具有与人类皮肤具有相似结构的三维培养皮肤。如本文所用，术语“成纤维细胞”是指构成纤维结缔组织的重要组分的细胞，并且特别是指相对于与本专利技术相关的皮肤构成真皮的主要细胞。在本专利技术中，成纤维细胞可以来自人、小鼠、大鼠等，但来源不限于此。为了本专利技术的目的，在制备三维培养皮肤模型的过程中，用于制备真皮的成纤维细胞可以是，特别是鼠成纤维细胞，例如3T3-J2、NIH3T3、3T6、3T12、3T12A或6T6细胞系，或典型地是鼠成纤维细胞系3T3-J2。此外，本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备包含真皮和表皮的三维培养皮肤模型的方法，其包括：(a)将包含鼠成纤维细胞、和天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物接种到培养皿中并使其固化以制备真皮；(b)将角质化细胞接种在步骤(a)中制备的真皮上并培养直到在其上形成细胞片层；和(c)将在步骤(b)中的细胞片层升高到空气/液体界面以形成表皮的上层。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.09 KR 10-2014-00861481.一种制备包含真皮和表皮的三维培养皮肤模型的方法，其包括：(a)将包含鼠成纤维细胞、和天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合的组合物接种到培养皿中并使其固化以制备真皮；(b)将角质化细胞接种在步骤(a)中制备的真皮上并培养直到在其上形成细胞片层；和(c)将在步骤(b)中的细胞片层升高到空气/液体界面以形成表皮的上层。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)中，所述天然胶原包括由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的α-1链和由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的α-2链；并且所述去端肽胶原包括由SEQIDNO：3的氨基酸序列组成的α-1链和由SEQIDNO：4的氨基酸序列组成的α-2链。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)中，所述真皮包含天然胶原和去端肽胶原的组合。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述去端肽胶原和天然胶原以1:0.1至1:20的比例组合。5.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用鼠成纤维细胞来形成真皮，以与使用人成纤维细胞时相比显示至少一种以下特性：i)真皮结构的稳定性增加；ii)表皮分化增加；iii)真皮收缩的抑制；iv)胶原降解的抑制；v)MMP表达水平降低；和vi)成片层能力增加。6.根据权利要求1所述的方法，其中，真皮由天然胶原或天然胶原与去端肽胶原的组合形成，以与单独使用去端肽胶原时相比显示出至少一种以下特性：i)真皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：全世华，金伦希，文玹阿，
申请(专利权)人：全世华，
类型：发明
国别省市：韩国;KR