一株寄生曲霉及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一株寄生曲霉，该寄生曲霉菌为寄生曲霉Aspergillus parasiticus RWSF001‑02，保藏于“广东省微生物菌种保藏中心”，保藏号为GDMCC NO：60080。所述寄生曲霉菌是从因真菌寄生自然死亡的蚜虫中筛选出的。所述寄生曲霉及含有所述寄生曲霉孢子的孢子粉可用于制备杀虫剂，尤其是对蚜虫具有较高的防治率，且该菌株生产性状好、生长迅速，在固体培养基中培养3～5天后产孢量可达8×108/g。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于害虫生物防治
，涉及一株寄生曲霉及其制备方法及应用。
技术介绍
自专利技术化学农药之后，化学农药以每年5%惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业作为增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的抗药性、农药残留等一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。同时化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。随着无公害农产品需求的日益增长和市场的良性发展，应用微生物杀虫剂防治害虫的呼声越来越高，因此亟需研究开发新型微生物杀虫剂及其产业化关键技术，特别是温室刺吸式害虫如蚜虫等，它们繁殖力强，抗药性强，更需要生物防治。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一株寄生曲霉菌及其制备方法，所述寄生曲霉菌可应用于制备真菌杀虫剂或含真菌成分的混合杀虫剂，来防治蚜虫等害虫。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一株寄生曲霉菌，所述寄生曲霉菌是从因真菌寄生自然死亡的蚜虫中筛选出的寄生曲霉菌株AspergillusparasiticusRWSF001-02，已于2016年9月21日保藏于“广东省微生物菌种保藏中心”，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏号为GDMCCNO：60080，菌株的分类命名为寄生曲霉菌株AspergillusparasiticusRWSF001-02。本专利技术获得所述寄生曲霉菌AspergillusparasiticusRWSF001-02的步骤为：首先选取因真菌寄生自然死亡的蚜虫，利用75%的酒精浸泡30min后用蒸馏水冲洗3～5次，将处理感染的蚜虫放入到PDA培养基的固体平板中并在温度为28℃培养48h，然后挑取单菌落进行分离，并对分离得到的几株菌株进行室内防治蚜虫效果试验，反复筛选出一株具有高杀虫性、生长状态好的寄生曲霉菌株。为了进一步提高本专利技术所提供的菌株的长势及其产孢性状以便更适于孢子批量生产，将筛选出的该菌株菌种转接到PDA液体培养基中，并置于摇床上在28℃环境下培养24h，制成菌丝液体种子。将所述菌丝液体种子按照2%～5%的接种量接种到由质量比为1：（1～3）：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中，保持空气湿度50%，在温度为25℃～30℃条件下培养3～5天，待固体培养基表面布满孢子后将该固体培养基进行风干，从而制成含量大于8×108/g的孢子粉产品。本专利技术所得到的菌株具有以下生物学特性：菌落形态特征：将经PDA液体培养基培养所获得的菌丝液体种子接种到由玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中培养3～5天后，所得菌落初为白色，黄绿色，继而变成黄褐色；产孢量达8×108/g；分生孢子头呈放射形，少有疏松柱状，分生孢子梗多为单层，少有双层，分生孢子椭圆形。生长特性：对该菌株进行生长特性研究，获得其最适宜的生长温度为25℃～30℃，最适宜空气湿度为50%。将经固体培养基中培养3～5天后得到的菌株菌落，提取其基因组DNA，并采用常规的寄生曲霉菌DNA扩展引物对该DNA进行扩增，并分别用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，切割所需DNA目的条带对该菌株的ITSDNA序列的PCR产物进行测序，测序结果见基因序列表SEQ.IDNo.1。从所述基因序列表SEQ.IDNo.1中分析得出该菌株的DNA-ITS序列共有574bp，该菌株属于与曲霉属Aspergillus的寄生曲霉AspergillusparasiticusRWSF001-02基因同源性概率较高。综上所述，通过综合该菌株的菌落形态、分生孢子形态、培养条件及分子生物学鉴定结果表明，该菌株属于曲霉属Aspergillus的寄生曲霉AspergillusparasiticusRWSF001-02。本专利技术提供的所述寄生曲霉菌株从孢子萌发开始侵染到菌体重新在虫体上产生孢子的过程可分为10个阶段，即经过孢子附着于寄主表皮、孢子萌发、穿透表皮、菌丝在血腔内生长、毒素产生、寄主死亡、菌丝侵入寄主的所有器官、菌丝穿出表皮、产生孢子、侵染单位的扩散这十个阶段。该菌株只要能够完成前四个阶段，就能够对寄主造成入侵和感染；当病原真菌在体内的菌丝大量繁殖时，就可导致寄主死亡。因此，本专利技术提供的所述寄生曲霉菌或含有所述寄生曲霉菌孢子的孢子粉可用来制备杀虫剂，尤其是采用含有所述寄生曲霉菌孢子的孢子粉来制备的杀虫剂喷雾水溶液中，所述寄生曲霉菌孢子含量在8×105～4×106时对蚜虫具有较高的防治率。在利用本专利技术提供的所述寄生曲霉菌进行防治蚜虫时，将由质量比为1：（1～3）：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基制得的所述曲霉菌株孢子粉产品用水稀释500～1000倍后进行喷雾，喷雾3～5天后，当环境湿度在75%以下时，被该菌种感染的蚜虫虫体变黑、干瘪，用体式显微镜可以发现蚜虫表皮气孔处有菌丝出现；而当环境湿度在75%以上时蚜虫虫体呈现黄褐色且全身覆满寄生曲霉孢子。结果表明，本专利技术提供的所述曲霉菌株被水稀释倍数1：500与1：750的蚜虫防效可达92%以上。因此，本专利技术提供的所述寄生曲霉菌可用于防治各种植物蚜虫，能有效地控制蚜虫种群数量。附图说明图1、本专利技术实施例提供的寄生曲霉菌株在30万倍光学显微镜下的分生孢子梗形态。图2、本专利技术实施例提供的寄生曲霉菌株在光学显微镜下的分生孢子头形态。具体实施方式下面通过具体实施方式，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。本实施例提供一株从因真菌寄生自然死亡的萝卜蚜虫中筛选出的寄生曲霉菌株，该菌株的获取、培养和鉴定方法包括以下步骤：菌株的分离：首先选取因真菌寄生自然死亡的萝卜蚜虫，利用75%的酒精浸泡30min后用蒸馏水冲洗3～5次，然后将处理后感染的蚜虫放入到PDA培养基的固体平板中并在温度为28℃培养48h，然后挑取单菌落进行分离，并对分离得到的几株菌株进行室内蚜虫生测试验，反复筛选出一株具有高杀虫性、生长状态好的菌株。菌株的鉴定：将经PDA液体培养基培养所得的菌丝液体种子接种到由质量比为1：1：1的玉米面、麸皮和豆粕组成的固体培养基中培养3～5天后观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小的具体形态特征参见图1和图2。从图中可以看出所得菌落初为白色、黄绿色，继而变成黄褐色；分生孢子头呈放射形、少有疏松柱状，分生孢子梗多为单层、少有双层呈椭圆形。菌株的DNAITS序列扩增、序列测定及分子鉴定：从该菌株基因组DNA中扩增出1条约600bp的序列，PCR产物经测序后所得序列通过Blast与GenBank中已有的核酸序列进行对比，结果表明该菌株的DNAITS序列测序结果见SEQ.IDNo.1，该测序序列和AspergillusparasiticusRWSF001-02的序列同源性极高，从而验证该菌株为曲霉菌株AspergillusparasiticusRWSF001-02。为了进一步提高本专利技术所提供的菌株生长势及其产孢性状、以便更适于孢子批量生产，将该菌株的菌种转接到PDA液体培养基中，并置于摇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株寄生曲霉，其特征在于，它为寄生曲霉Aspergillus parasiticus RWSF001‑02，保藏于“广东省微生物菌种保藏中心”，保藏号为GDMCC NO：60080。

【技术特征摘要】
1.一株寄生曲霉，其特征在于，它为寄生曲霉AspergillusparasiticusRWSF001-02，保藏于“广东省微生物菌种保藏中心”，保藏号为GDMCCNO：60080。2.根据权利要求1所述的一株寄生曲霉，其特征在于，它的DNA-ITS序列如SEQIDNO.1所示。3.一种制备权利要求1或2所述的寄生曲霉菌的方法，其特征在于，该方法是以蚜虫体内寄生的原曲霉菌群作为菌种，采用PDA培养基培养和人工筛选的方法从而得到所述寄生曲霉菌。4.制备权利要求3所述的寄生曲霉菌的方法，其特征在于，它还包括采用固体培养基对所述寄生曲霉菌进行扩繁培养的步骤，其中，所述固体培养基由质量比为1：（1～3）：1的玉米面、麸皮和豆粕组成。5.根据权利要求4所述的寄生曲霉菌的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李静，王建红，王慧芳，王树伟，王振华，
申请(专利权)人：鹤壁市人元生物技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41