与DLL4和VEGF特异性结合的新型双靶向蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及新型双靶向蛋白，其包含：与δ样配体4(DLL4)特异性结合的蛋白，和与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性结合的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种新型双靶向蛋白，其包含：与δ样配体4(DLL4)特异性结合的蛋白和与血管内皮细胞生长因子(VEGF)特异性结合的抗体。技术背景已报道Notch信号传导在脊椎和无脊椎动物中是高度保守的且在发育的初始阶段决定细胞命运中起非常关键的作用。Notch信号传导已知为调节神经细胞、眼细胞、淋巴细胞、肌细胞、造血干细胞等分化的主要途径且还参与血管发育。哺乳动物具有四种Notch受体(Notch1、2、3和4)，且每种Notch受体作为具有300-350kDa大小的蛋白合成并在S1位点通过Golgi(高尔基)中的弗林蛋白酶样转化酶(furin-likeconvertase)裂解以在细胞表面形成异二聚体。此外，在哺乳动物中发现了四种Notch配体(锯齿状-1/2和δ样配体(DLL)1/3/4)。活化的Notch信号传导已知在多种肿瘤模型中诱导肿瘤生成。当在大鼠的造血干细胞中表达活化的NotchNICD时，发生T-细胞白血病/淋巴瘤，且在约50％的T-ALL(T-细胞急性淋巴性白血病)中发现活化的Notch1。此外，在乳腺癌的情况中，发现Notch4受体在引入MMTV(鼠乳腺肿瘤病毒)的大鼠(CzechII)中过表达，且已报道乳腺肿瘤在这些小鼠中的发生。已报道Notch受体和配体和Notch信号传导靶标在多种癌症如子宫颈癌，肺癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌和前列腺癌中活化。已知Notch1受体与乳腺癌患者更差的预<br>后相关且与前列腺癌的转移相关。δ样配体4(DLL4)(下文称为\DLL4\)是与在血管内皮细胞中过表达的Notch蛋白结合的δ类配体之一。其已知为调节血管生成的主要因子。DLL4与在血管内皮细胞中过表达的Notch1或Notch4特定结合。已知尽管其也在正常血管中表达，但DLL4在癌症血管中高度过表达。血管生成指新血管从预先存在的血管形成的机制。具体地，在肿瘤中，血管生成由血管生成因子如VEGF(血管内皮细胞生长因子)引起从而向癌症组织的缺氧区补给氧气和营养物。已知肿瘤中的血管生成不仅在肿瘤生长中起关键作用，也在肿瘤转移中起重要作用。当阻断肿瘤中通过DLL4的Notch信号传导时，血管生成不能容易受到控制，且因此可抑制肿瘤的生长。此外，当通过DLL4的Notch信号传导受到抑制时，自身免疫性疾病可通过增加调节性T细胞(Treg)的数目而治疗(美国专利公开号2011-0189200)。例如，DLL4在癌症和自身免疫疾病的治疗中成为新的靶标。同时，作为用于抑制血管生成的抗癌药物，靶向VEGF的(Genentech/Roche)已由FDA在2004批准且作为抗癌治疗剂已取得巨大成功。然而，近期的临床模型和临床前动物模型研究已表明所有固体肿瘤对VEGF抑制剂都不响应，且还报道了其中在初始阶段用VEGF抑制剂治疗一些肿瘤在一段时间后展示抗性的数个病例。此外，研究结果已报道，表明VEGF抑制剂的施用将癌细胞转变成更具侵略性且容易转移的癌细胞。这些研究报道推动了新型克服Avastin抗性或具有优于Avastin的效力的抗癌靶标的研究和开发。在这些新型抗癌靶标中，涉及DLL4/Notch信号传导途径的蛋白引起了关注。根据近日报道的研究结果，由于VEGF/VGEFR信号传导途径和DLL4/Notch信号传导途径通过不同机制影响血管生成，预期当两种信号传导途径都受到抑制时可获得较强的协同抗癌作用。
技术实现思路
技术问题本专利技术做出了巨大的努力以开发可特异性与源自人的DLL4和VEGF结合的双靶向蛋白从而有效抑制DLL4/Notch和VEGF/VEGFR信号传导途径且可最小化免疫原性的风险。结果，本专利技术构建了与人VEGF特异性结合的新型人单克隆抗体，它是双靶向蛋白，其中与人DLL4特异性结合的新型ScFv(单链可变片段)与类似于IgG型Avastin的蛋白的C末端区连接，且发现这种双靶向蛋白不仅有效地抑制VEGF和VEGF受体间的相互作用，还抑制DLL4和Notch蛋白间的相互作用，因此显示优异的抗癌效果，由此完成本专利技术。技术方案本专利技术的目的在于提供双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4蛋白氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65的氨基酸序列和第110-第115的氨基酸序列的构象表位。本专利技术的另一目的是提供编码上述双靶向蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和包含所述表达载体的转化子。本专利技术的另一目的是提供用于产生双靶向蛋白的方法。本专利技术的另一目的是提供包含上述双靶向蛋白的组合物。本专利技术进一步的目的是提供用于治疗癌症的药物组合物，其包含上述双靶向蛋白。本专利技术的另一目的是提供用于诊断癌症的组合物，其包含上述双靶向蛋白。本专利技术的再一目的是提供使用上述双靶向蛋白用于诊断癌症的方法。本专利技术的另一目的是提供DLL4的构象表位，其包含SEQIDNO:21所示的DLL4(δ样配体4)蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基第58-第65和第110-第115。本专利技术的另一目的是提供与DLL4特异性结合的单克隆抗体，其识别上文所述的构象表位。本专利技术的另一目的是提供编码所述单克隆抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体和包含所述表达载体的转化子。本专利技术的另一目的是提供用于治疗癌症的方法，其包括将上文所述的双靶向蛋白施用至疑似患有癌症的受试者的步骤。优势效果根据本专利技术的双靶向蛋白可通过VEGF和DLL4两者治疗癌症，并由于其包含与DLL4特异性结合的新型蛋白而展示优异的结合亲和力和抗癌效果。因此，其可在癌症治疗和诊断领域广泛使用。附图简述图1a和1b显示能够与DLL4和VEGF都结合的双靶向蛋白的结构。图2a显示通过在CHO细胞中表达能与DLL4和VEGF两者结合的双靶向蛋白、纯化表达的蛋白和通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白所获得的结果。图2b显示通过在CHO细胞中表达能与DLL4和VEGF两者结合的双靶向蛋白、纯化表达的蛋白和通过SEC-HPLC层析术分析纯化的蛋白所获得的结果。图3显示实施的酶联免疫吸附测定法(ELISA)以检查双靶向蛋白与DLL4和VEGF结合的能力的结果。图4a显示实施的Biacore试验以测量双靶向蛋白对于由双靶向蛋白所靶向的抗原DLL4的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白识别DLL4的包含由SEQ ID NO:21所示的DLL4蛋白氨基酸序列中氨基酸残基第58‑第65的氨基酸序列和第110‑第115的氨基酸序列的构象表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.09 KR 10-2013-00805231.一种双靶向蛋白，其包含：与DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF(血
管内皮细胞生长因子)特异性结合的抗体，其中所述与DLL4特异性结合的蛋
白识别DLL4的包含由SEQIDNO:21所示的DLL4蛋白氨基酸序列中氨基酸
残基第58-第65的氨基酸序列和第110-第115的氨基酸序列的构象表位。
2.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述特异性地与DLL4结合的蛋白包
含：
重链可变区，其包含具有由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的重链
CDR1、具有由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的重链CDR2和SEQIDNO:4
所示的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含具有由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的轻链
CDR1、具有由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQID
NO:7所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
3.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述双靶向蛋白的形式为：其中与
DLL4特异性结合的蛋白和与VEGF特异性结合的IgG(免疫球蛋白G)型抗体
彼此通过接头连接。
4.权利要求3的双靶向蛋白，其中所述接头是肽基接头或非肽接头。
5.权利要求4的双靶向蛋白，其中所述肽接头具有由SEQIDNO:18所
示的氨基酸序列。
6.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述与DLL4特异性结合的蛋白包含
由SEQIDNO:8所示的重链氨基酸序列和由SEQIDNO:9所示的轻链氨基
酸序列。
7.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述特异性与VEGF结合的抗体包含：
重链可变区，其包含具有由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的重链
CDR1、具有由SEQIDNO:11所示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQ
IDNO:12所示的氨基酸序列的重链CDR3，和
轻链可变区，其包含具有由SEQIDNO:13所示的氨基酸序列的轻链
CDR1、具有由SEQIDNO:14所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ
IDNO:15所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.权利要求1的双靶向蛋白，其中所述与VEGF特异性结合的抗体包含

\t具有由SEQIDNO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和具有由SEQID
NO:17所示的氨基酸序列的轻链可变区。
9.权利要求8的双靶向蛋白，其中所述与VEGF特异性结合的抗体是贝

【专利技术属性】
技术研发人员：李东宪，文庆德，崔裕彬，姜庆在，金东寅，安珍衡，刘原圭，郑镇沅，
申请(专利权)人：韩华石油化学株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR