用于在基于乳液的微流体中测序的系统和方法技术方案

提供了用于核苷酸测序的方法、文库和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在基于乳液的微流体中测序的系统和方法相关申请的交叉参考本申请要求2013年5月29日提交的美国临时专利申请号61/828,582的优先权，该文通过引用纳入本文。
技术介绍
DNA测序是确定DNA分子中核苷酸的精确顺序的过程，例如DNA链中四种碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的顺序。快速DNA测序方法的出现极大地加速了生物和药学研究和发现。DNA序列的知识已用于基础生物学研究和多种应用领域，例如诊断、生物技术、法医生物学和生物系统学。使用现代DNA测序技术获得快速测序已被用于完整DNA序列或多种类型和物种的基因组(包括人基因组和许多动物、植物和微生物物种的其他完整DNA序列)的测序。
技术实现思路
本专利技术提供了确定靶核酸中核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，该方法包括，划分包含多个靶核酸拷贝的混合物，从而生成多个靶划分产物；在多个引物划分产物中提供一系列引物，至少大部分引物划分产物包含两种或更多种引物，所述引物具有至少4个指定核苷酸，这些引物的其他核苷酸位置(如果有)是简并位置或通用核苷酸；以一比一的基础合并(i)至少一部分靶划分产物和(ii)引物划分产物以形成多个反应划分产物；在完全互补的引物与靶核酸杂交且不完全互补的引物不与靶核酸杂交的条件下在反应划分产物中使靶核酸杂交引物；确定该系列中哪些引物结合靶核酸；以及基于结合靶核酸的引物确定靶核酸中的核苷酸顺序。在一些实施方式中，该系列的引物包含指定核苷酸数目不同的至少2、3或4种引物，指定核苷酸多于4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，例如一些引物具有一种数目(如X>4)的指定核苷酸且该系列中的其他引物具有不同数目(如Y>4)。在一些实施方式中，生成至少100、500、1000或10000份部分的靶划分产物；且所述合并包括将100、500、1000或10000份部分中的每一个与不同的引物划分产物合并。在一些实施方式中，该靶核酸是扩增子。在一些实施方式中，该靶核酸包含荧光部分且退火至包含淬灭剂的淬灭寡核苷酸，其中，淬灭剂退火至靶核酸淬灭荧光部分的荧光。在一些实施方式中，所述确定包括使退火至淬灭剂寡核苷酸的靶核酸接触引物依赖性聚合酶，如果杂交，该引物的延伸导致淬灭剂寡核苷酸的置换，从而生成荧光信号。在一些实施方式中，分成的各份引物包含具有不同序列的多种引物，且所述确定包括：检测是否存在荧光信号，存在荧光信号表示多种引物之一杂交至靶核酸而缺少荧光信号表示多种引物无一杂交至靶核酸；且该方法还包括基于是否存在荧光信号和引物序列反卷积(deconvolute)靶核酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，这些引物划分产物含有一种或多种与划分产物中具体引物具有一致性关联的分光光度物质，从而可通过检测划分产物的分光光度特征确定划分产物中引物的序列，且所述确定还包括检测分光光度特征并将分光光度特征与引物序列关联。在一些实施方式中，该系列引物包含n组引物，具有含有不同组引物的不同划分产物，不同的引物组具有2-20种不同的独特引物且不同的引物划分产物之间具有不超过一种共有引物，其中n是1000-300000。在一些实施方式中，n组中每一组的划分产物含有一种或多种分光光度物质，使得n组中的每一组都可通过分光光度特征区分。在一些实施方式中，该组中的至少大部分引物出现在两个不同的引物组中。在一些实施方式中，引物划分产物中任两种引物的序列没有超过两个核苷酸的重叠。在一些实施方式中，这些系列中的一些引物具有6-18个(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)指定核苷酸。在一些实施方式中，这些指定核苷酸是连续的。在一些实施方式中，这些指定核苷酸至少一些是不连续的，使得指定核苷酸中至少两个被至少一个简并核苷酸位置或通用核苷酸隔开。在一些实施方式中，这些系列具有400-16000种不同序列的引物。在一些实施方式中，该靶核酸的长度为50-1000个核苷酸。在一些实施方式中，该靶核酸包含3’茎环。在一些实施方式中，这些划分产物是液滴。在一些实施方式中，这些液滴包含在乳液中。还提供了至少n种不同引物划分产物的文库，这些引物划分产物包含n组引物，不同划分产物含有不同引物组，各组引物具有2-20种不同的独特引物且不同的引物划分产物之间具有不超过一种共有引物。在一些实施方式中，n是1000-300000。在一些实施方式中，不同的引物具有至少4个指定核苷酸，引物的其他核苷酸位置(如果有)是简并位置或通用核苷酸。在一些实施方式中，引物划分产物包含n组引物，不同划分产物含有不同引物组，各引物组具有8-12种不同的独特引物且不同的引物划分产物之间具有不超过一种共有引物。在一些实施方式中，n组中每一组的划分产物含有一种或多种分光光度物质，使得n组中的每一组都可通过分光光度特征区分。在一些实施方式中，该组中的至少大部分引物出现在两个不同的引物组中。在一些实施方式中，引物划分产物中任两种引物的序列没有超过一个、两个或三个核苷酸的重叠。在一些实施方式中，一些(或大部分)引物具有6-18个指定核苷酸。在一些实施方式中，一些、大部分或全部指定核苷酸是连续的。在一些实施方式中，这些指定核苷酸至少一些是不连续的，使得指定核苷酸中至少两个被至少一个简并核苷酸位置或通用核苷酸隔开。在一些实施方式中，文库包含400-16000种不同序列的引物。在一些实施方式中，这些划分产物是液滴。在一些实施方式中，这些液滴包含在乳液中。还提供了包含上述或本文其它地方所述的文库的容器。在一些实施方式中，该容器包含一个或多个与文库流体连通的微流体通道。还提供了用于生成靶核酸的核苷酸序列的系统。在一些实施方式中，该系统包含第一容器、第一微流体通道和检测器，所述第一容器包含多个引物液滴中的一系列引物，其中至少大部分引物液滴包含两种或更多种不同引物，所述引物具有至少4个指定核苷酸，引物的其他核苷酸位置(如果有)是简并位置或通用核苷酸，所述第一微流体通道提供第一容器和检测器之间的流体连通。在一些实施方式中，该系统还包含含有用于扩增靶核酸的引物对的第二容器；提供第二容器与第一微流体通道之间流体连通的第二微流体通道；以及与第二微流体通道流体连通的样品核酸容器。在一些实施方式中，该系统还包含第一液滴注射器和第二液滴注射器，所述第一液滴注射器构设成将核酸从样品核酸容器中注入包含来自第二容器的引物对且位于第二微流体通道中的液滴内以形成混合物液滴，所述第二液滴注射器构设成将混合物液滴分成的各份注入向下游通过第一微流体通道的引物液滴中。在一些实施方式中，这些液滴包含在乳液中。在一些实施方式中，该第二微流体通道的一部分是蜿蜒的。在一些实施方式中，该第一容器包含至少100、500、1000或10000个所述引物液滴。在一些实施方式中，该系统还包含一个或多个泵，用于推动液滴通过一个或多个微流体通道。在一些实施方式中，该组中的至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定靶核酸中核苷酸序列的方法，所述方法包括，划分包含靶核酸的多个拷贝的混合物，从而生成多个靶划分产物；以多个引物划分产物提供一系列引物，至少大部分所述引物划分产物包含两种或多种不同的引物，所述引物具有至少4个指定核苷酸，所述引物的其他核苷酸位置在存在时是简并位置或通用核苷酸；以一比一合并(i)所述靶划分产物的至少一部分和(ii)引物划分产物以形成多个反应划分产物；在完全互补的引物与所述靶序列杂交且不完全互补的引物不与所述靶核酸杂交的条件下在所述反应划分产物中使所述靶核酸与所述引物杂交；确定所述系列中的何种引物与所述靶核酸杂交；以及基于何种引物与所述靶核酸杂交确定靶核酸中的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.29 US 61/828,5821.一种确定靶核酸中核苷酸序列的方法，所述方法依赖于不同引物序列与靶核酸的杂交或缺少杂交，所述方法包括，
划分包含靶核酸的多个拷贝的混合物，从而生成多个靶划分产物，所述靶划分产物是液滴；
以多个引物划分产物提供一系列被设计成与靶核酸杂交的引物，至少大部分所述引物划分产物包含两种或更多种不同的引物，所述两种或更多种不同的引物具有至少4个指定核苷酸，所述引物挑选为依据核酸序列中存在的变体与靶核酸序列杂交，其中，各引物出现在多个不同引物划分产物中，并且，任两个引物组的交集都不含超过一种共同的引物，各引物组含有已知数目和特征的引物，所述一系列被设计成与靶核酸杂交的引物包含指定核苷酸的引物序列的可能组合的至少40%；
以一比一合并(i)所述靶划分产物的至少一部分和(ii)引物划分产物以形成多个反应划分产物；
在完全互补的引物与所述靶核酸序列杂交且不完全互补的引物不与所述靶核酸杂交的条件下在所述反应划分产物中使所述靶核酸与所述引物杂交；
确定所述系列中的何种引物与所述靶核酸杂交，当且仅当划分产物中含有的所有引物都不杂交时，划分产物生成试验阴性应答；所述靶核酸包含荧光部分且退火至包含淬灭剂的淬灭寡核苷酸，所述淬灭剂退火至所述靶核酸淬灭所述荧光部分的荧光；所述确定包括使退火至淬灭剂寡核苷酸的所述靶核酸接触引物依赖性聚合酶，如果杂交，所述引物的延伸导致所述淬灭剂寡核苷酸被置换，从而生成荧光信号；所述确定还包括检测是否存在所述荧光信号，存在所述荧光信号表示所述多种引物之一与所述靶核酸杂交，且缺少所述荧光信号表示所述多种引物无一与所述靶核酸杂交；以及
基于何种引物与所述靶核酸杂交以及何种引物与所述靶核酸不杂交来确定靶核酸中的核苷酸序列；
所述引物划分产物含有一种或多种与划分产物中具体引物一致性关联的分光光度物质，由此可通过检测所述划分产物的分光光度特征来确定所述划分产物中引物的序列，且所述确定还包括检测分光光度特征并将所述分光光度特征与所述引物的序列关联。


2.如权利要求1所述的方法，所述一系列引物包含指定核苷酸数目不同的至少2种引物，指定核苷酸多于4个核苷酸。

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【专利技术属性】
技术研发人员：J·希利，
申请(专利权)人：基纽拜奥股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US