本发明专利技术公开了一种从衣藻的油脂中提取脂蛋白的方法。首先破碎营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞，活性剂清洗除去匀浆中的细胞器，然后盐洗析出杂蛋白，之后尿素清洗使剩余的溶解性蛋白变性沉淀，再用正己烷清洗防止蛋白质被氧化，蔗糖梯度离心后进行蛋白电泳，电泳结束后将目标条带切下进行电泳洗脱得到脂蛋白。本发明专利技术克服常规有机溶剂萃取方法中的不足，通过蛋白物理性质和化学性质对杂蛋白进行去除，采用蔗糖梯度离心法不断洗脱杂蛋白最终得到油脂中的脂蛋白，保护油脂中的脂蛋白不受影响，为脂蛋白的相关研究及油脂代谢研究提供基础，在微藻油脂代谢研究中具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质工程及微生物
，具体涉及一种从衣藻的油脂中提取脂蛋白的方法。
技术介绍
生物柴油是指以油料作物如大豆、油菜、棉、棕榈等，野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换或热化学工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。海洋微藻可以在一定的生理条件下积累大量的油脂，其中主要是甘油三酯(TAG)，可作为一种可再生的生物能源，日益受到关注。已有研究发现，在缺少氮或硫等元素的培养条件下，莱茵衣藻能够快速的积累主要成分为甘油三酯的油脂。莱茵衣藻是一种单细胞真核微藻，目前它的全基因组测序已经完成，这使得它能够成为研究微藻油脂代谢途径的模式藻株。脂蛋白是与脂质结合在一起形成的脂质-蛋白质复合物。脂蛋白中脂质与蛋白质之间没有共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组分之间以疏水性相互作用而结合在一起。现有的油脂提取方法主要来自于E.G.Blight (Canadian Journal ofB1chemistry and Phys1logy 1959,37:911-917.)和 Jordi Folch (J.B1l.Chem.1957，226:497-509.)的报道，主要利用氯仿和甲醇以及水形成分层和油脂在氯仿以及甲醇中溶解度不同进行萃取。此方法虽然快捷，但是毒性较大，且容易造成脂蛋白丢失。脂蛋白的相关研究可以为微藻中油脂合成相关蛋白提供更多有利的数据，然而相关脂蛋白的研究未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中从微藻中提取油脂时毒性较大，脂蛋白易被破坏，无法提取出脂蛋白的缺陷，本专利技术提供了。本专利技术的技术方案如下:，包括以下步骤:步骤1，破碎处理，首先将营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞溶液离心收集沉淀，然后加入包含蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物的ifepes-KOH缓冲液重悬细胞沉淀，之后将细胞破碎，匀浆中加入包含0.2M?0.3M蔗糖的Η印es-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤2，活性剂清洗，用包含0.1 %?0.2 %的吐温-20和0.2M?0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤1收集的油脂，再加入ifepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤3，盐洗，用包含1M?3M NaCl和0.4?0.6M蔗糖的Η印es-KOH缓冲液重悬步骤2收集的油脂，再加入包含2M?3M NaCl和0.2M?0.3M蔗糖的!fepes-K0H缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤4，尿素清洗，用8M?10M尿素重悬步骤3收集的油脂，轻微摇晃让余下的蛋白充分变性，再加入Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤5，正己烷清洗，将步骤4收集的油脂层与包含质量浓度为0.003%?0.005%的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的正己烷混合，震荡后经高速冷冻离心后收集包含油脂的正己烷相，用高纯氮气吹干正己烷；步骤6，蔗糖梯度离心，用包含0.4M?0.6M蔗糖的ifepes-KOH缓冲液重悬步骤5吹干的油脂，再加入包含0.2M?0.3M蔗糖的ifepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤7，蛋白电泳，将步骤6收集的油脂进行蛋白电泳；步骤8，电泳洗脱，电泳结束后将目标条带切下并清洗干净，然后进行电泳洗脱即得到目的蛋白液。步骤1中，所述的植物蛋白酶抑制剂混合物由4-2-氨乙基苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、苯丁抑制剂、胃酶抑制剂A、E-64、亮抑酶肽和1，10-邻菲咯啉组成。所述的Η印es-KOH缓冲液的浓度为25mM，pH值为?.5。步骤1中，离心速度为1000g。步骤2?步骤6中，离心速度为50000g。本专利技术克服常规有机溶剂萃取方法中的不足，通过蛋白物理性质和化学性质对杂蛋白进行去除，采用蔗糖梯度离心法不断洗脱杂蛋白最终得到油脂中的脂蛋白，保护油脂中的脂蛋白不受影响，为脂蛋白的相关研究及油脂代谢研究提供基础，在微藻油脂代谢研究中具有潜在的应用价值。【附图说明】图1为本专利技术的脂蛋白提取过程中各步骤收集的油脂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。【具体实施方式】下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详细说明。实施例11.营养胁迫处理莱茵衣藻培养衣藻所用试剂以及方法TAP来自于Gorman, D.S.and R.P.Levine (Proc.Natl.Acad.Sc1.1965，54:1665-1669.)论文中所述方法。从固体培养基上取单一菌落的衣藻接种在TAP液体培养基中，在22°C光照摇床中培养至0D6QQ= 1.0，1000g离心10分钟，衣藻重悬于NO液体培养基中。两天后，取980uL藻液放入1.5mL离心管中，加入20uL事先配制好的尼罗红染色溶液(lmg/mL)，避光40°C孵育10分钟。用移液枪吸取10uL孵育后的藻液在干净的载玻片上，加上干净的盖玻片。使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜进行荧光观察。先使用低倍物镜观察，在明场中找到衣藻细胞。换用高倍油镜，在盖玻片上滴一滴专用显微镜油，将焦平面对角到衣藻上。使用490nm激发光，同时设定560?620nm发射波长和650_720nm发射波长，可以观察到强烈的桔黄色荧光和红色的叶绿体自体荧光，证明莱茵衣藻中已经积累了大量油脂。2.破碎处理配制25mM，pH7.5的！fepes-KOH缓冲液。称量500mL衣藻细胞在4°C下1000g离心lOmin收集沉淀。用50mL包含0.6M蔗糖和植物蛋白酶抑制剂混合物的Hepes-KOH缓冲液中重悬细胞沉淀。通过弗氏压碎器破碎这些细胞(1500psi = 103bar)，匀浆加入到离心管中，加入包含0.2M?0.3M蔗糖Hepes-KOH缓冲液到离心管顶部。离心管在4°C下10000g离心30min，收集顶部的油脂层。3.活性剂清洗吐温-20是一种常用非离子表面活性剂，可以用来清洗匀浆中的破碎的细胞器官。用活性剂溶液(包含(λ 1 %?0当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，破碎处理，首先将营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞溶液离心收集沉淀，然后加入包含蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物的Hepes‑KOH缓冲液重悬细胞沉淀，之后将细胞破碎，匀浆中加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤2，活性剂清洗，用包含0.1％～0.2％的吐温‑20和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤1收集的油脂，再加入Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤3，盐洗，用包含1M～3M NaCl和0.4～0.6M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤2收集的油脂，再加入包含2M～3M NaCl和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤4，尿素清洗，用8M～10M尿素重悬步骤3收集的油脂，轻微摇晃让余下的蛋白充分变性，再加入Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤5，正己烷清洗，将步骤4收集的油脂层与包含质量浓度为0.003％～0.005％的2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚的正己烷混合，震荡后经高速冷冻离心后收集包含油脂的正己烷相，用高纯氮气吹干正己烷；步骤6，蔗糖梯度离心，用包含0.4～0.6M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液重悬步骤5吹干的油脂，再加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes‑KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；步骤7，蛋白电泳，将步骤6收集的油脂进行蛋白电泳；步骤8，电泳洗脱，电泳结束后将目标条带切下并清洗干净，然后进行电泳洗脱即得到目的蛋白液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢颖洪，王宇，周敏，戴红林，刘毅，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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