饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。本发明专利技术使用的混合酸性流动相等度洗脱，同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求，样品前处理简单，检测结果准确可靠。具体可参见实施例中的实验分析。

【技术实现步骤摘要】
饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法
本专利技术涉及一种一次性同时测定多种抗菌增效剂的方法，属于药物的检测领域。
技术介绍
四氢叶酸作为一碳转移酶的辅酶，在机体的代谢中发挥着巨大的作用。细菌等一些病原微生物不能利用外源性的叶酸，需要以对氨基苯甲酸等为底物在二氢叶酸合成酶的作用下，生成二氢叶酸；再在二氢叶酸还原酶的作用下生成四氢叶酸。磺胺类药物与对氨基苯甲酸结构相似，可以干扰细菌等病原微生物的二氢叶酸合成。二甲氧苄氨嘧啶(亦称二甲氧苄啶，diaveridine,DVD，CAS：5355-16-8)、三甲氧苄氨嘧啶(亦称甲氧苄啶，trimethoprim,TMP，CAS：738-70-5)和二甲氧甲基苄氨嘧啶(亦称二甲氧甲基苄啶，ormetoprim,OMP，CAS：6981-18-6)被称作抗菌增效剂，能抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能还原为四氢叶酸，从而妨碍核酸和蛋白质的合成。DVD等与磺胺类药物合用时，可以从两个不同的环节阻断病原微生物的叶酸合成代谢，使磺胺类药物的疗效显著增强，因此常与磺胺类药物混合添加于猪、禽饲料中，用于肠道感染的治疗和球虫病的防治。该类药物还能与其他抗菌药物、抗球虫药物，以及中草药等联用，增强其药效。DVD与其他磺胺类药物配伍添加于配合饲料中，仅作为治疗药物用于猪肠道感染和鸡球虫病的防治，而TMP和OMP则禁止添加于动物饲料中。该类药物理化性质稳定，能通过食物链在动物体内长期存在而造成危害，农业部公告第235号中对动物性食品中TMP的最高残留限量(MRL)做了如下规定：牛、猪、禽、鱼，50μg/kg；马，100μg/kg；日允许摄入量(ADI)为0～4.2μg/kg。该类药物在广泛应用的同时，许多国家对饲料中该类药物的添加量有着严格规定。如农业部公告第168号中磺胺喹噁啉二甲氧苄啶预混剂，用于禽球虫病的治疗，其中DVD在配合饲料中的添加量为20mg/kg；再如《中国兽药典兽药使用指南——化学药品卷》中磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶预混剂，用于猪胃肠道细菌感染和鸡球虫病的治疗，其中DVD在配合饲料中的添加量为40mg/kg。为了有效地监测和控制饲料中该类药物的添加量，急需开发一个准确、高效和简便的分析方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种准确、高效和简便的同时一次性分析检测饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的含量的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来具体实现：一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。优选的，所述流动相为甲醇与0.2％的甲酸水溶液以体积比2:8混合所得。优选的，采用等度洗脱的方式进行色谱柱分离。优选的，色谱分离时，流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样量为5μl。优选的，所述串联质谱检测的条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值为+300V，干燥气温度为350℃，干燥气流速为11L/min，进行多重离子反应监测。本专利技术所分析的饲料样品为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料。本专利技术使用的混合酸性流动相等度洗脱，同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求，样品前处理简单，检测结果准确可靠。不同品种的饲料中，DVD、TMP和OMP的添加量分别为20μg/kg时，DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于3(按照峰高对峰高计)，表明方法的检测限可至20μg/kg，即0.02mg/kg。不同品种的饲料中，DVD、TMP和OMP的添加量分别为40μg/kg时，DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于10(按照峰高对峰高计)，表明方法的检测限可至40μg/kg，即0.04mg/kg。不同品种的饲料中，添加不同量的各化合物，回收率均在70％～120％的范围内，批内和批间的变异系数均小于20％。具体可参见实施例中的实验分析。附图说明图1为配合饲料中DVD、TMP和OMP的分离色谱图，其中第一个色谱峰为DVD，第二个色谱峰为TMP，第三个色谱峰为OMP。具体实施方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：一、色谱分离和质谱检测条件色谱柱为AgilentEclipsePlusC18(3.0mm×100mm，1.8μm)；在线预过滤芯(4mm,5μm,GRACE,USA)，流动相为甲醇-0.2％甲酸水溶液(20:80，v/v)，等度洗脱，流速0.3ml/min，柱温40℃，进样量5μl。离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值(DeltaEMV)为+300V，干燥气温度为350℃，干燥气流速为11L/min(N2)，进行多重离子反应监测(MRM)，具体参数见表1。表1各化合物的MRM参数及特征离子对注：*，为定量离子二、标准曲线的建立分别精确称取DVD、TMP和OMP标准品约0.01g于不同的50mL烧杯中，用流动相(甲醇-0.2％甲酸溶液，20+80)溶解后，转移到10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，混匀，配制成质量浓度为1mg/mL的DVD、TMP和OMP单个标准储备溶液。4℃条件下贮藏。分别准确吸取1mL上述单个标准储备溶液，于同一100mL容量瓶中，以流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即为质量浓度为10μg/mL的混合标准储备溶液；准确吸取混合标准储备溶液2mL于10mL容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，即为质量浓度为2μg/mL的混合标准工作溶液；准确吸取2μg/mL的混合标准工作溶液2mL于10mL容量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，即为质量浓度为400ng/mL的混合标准工作溶液；同法依次连续进行4次5倍稀释，制得DVD、TMP和OMP质量浓度均为80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL和0.64ng/mL的混合标准工作溶液。在上述色谱和质谱条件下检测，以定量离子的峰面积与浓度进行线性回归。各化合物的标准曲线及线性范围见表2。结果表明各化合物在对应的浓度范围内线性关系良好。表2各化合物的标准曲线及线性范围三、饲料样品的提取与净化称取一定量的试样(配合饲料2g，浓缩饲料和预混合饲料各1g，精确至0.001g)，置于50mL塑料离心管内，加1mol/L的乙酸钠溶液10mL，盖好密封盖涡旋混合1min，加入二氯甲烷20mL，盖好密封盖涡旋混合2min，水浴超声30min，每隔10min涡旋一次，每次2min。取出后，1800g离心分离15min。用注射器吸取下层的二氯甲烷提取液8mL于10mL离心管中，1800g离心分离10min，小心吸取再次离心过的二氯甲烷提取液2mL于另一10mL离心管中，40℃条件下氮气吹至近干，加入甲醇-0.2％甲酸混合溶液(20+80，流动相)1mL，水浴超声使残渣完全溶解，再加入2mL正己烷，涡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，其特征在于：使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。

【技术特征摘要】
1.一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，其特征在于：使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离，进行串联质谱检测；所述流动相为甲醇与0.2%的甲酸水溶液以体积比2:8混合所得。2.根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑勇，杨亚军，刘希望，李冰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62