修饰的RNAi试剂制造技术

本发明专利技术的一个方面涉及能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)双链体试剂。该dsRNA双链体在一条或两条链中包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，特别是在该链的裂解位点处或附近。本发明专利技术的其他方面涉及包括这些适于治疗用途的dsRNA试剂的药物组合物以及通过给予这些dsRNA试剂来抑制一种靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术的一个方面涉及能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)双链体试剂。该dsRNA双链体在一条或两条链中包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，特别是在该链的裂解位点处或附近。本专利技术的其他方面涉及包括这些适于治疗用途的dsRNA试剂的药物组合物以及通过给予这些dsRNA试剂来抑制一种靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病病症。【专利说明】修饰的RNAi试剂 相关申请 本申请要求于2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561，710的优先权， 将该申请的全部内容通过引用特此结合在此。 专利
本专利技术涉及具有有利抑制靶基因表达的特定基序的RNAi双链体试剂以及适于治 疗使用的RNAi组合物。额外地，本专利技术提供了通过给予这些RNAi双链体试剂来抑制靶基 因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病。 背景 RNA干扰或"RNAi"是一个最初由费尔（Fire)和同事创造的术语，用来描述观察 到双链RNAi(dsRNA)可以阻断基因表达（菲尔等人（1998)Nature(自然）391，806-811 ; Elbashir (艾巴施）等人（2001)Genes Dev.(基因与发育）15，188-200)。短 dsRNA 在许多 有机体（包括脊椎动物）中指导基因特异性的转录后沉默，并且已经为研究基因功能提供 了一个新的工具。RNAi由RNA诱导沉默复合体（RISC)介导，RISC是一种破坏与沉默触发 物同源的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶。已知RISC包含来自双链RNA触发物的短 RNA(大约22个核苷酸），但是这一活性的蛋白组分仍是未知的。 基于RNA干扰（RNAi)的药物开发需要具有良好基因沉默特性的双链RNA (dsRNA) 分子。RNAi中的最初步骤是RNA诱导沉默复合体（RISC)的活化，这需要降解dsRNA双链体 的有义链。已知有义链作为被在双链体区的中部的Argonaute2裂解的第一 RISC底物。有 义链的裂解的5'-端和3'-端片段从核酸内切酶Ag〇2移除后，RISC立刻被反义链活化 (Rand(兰德）等人（2005) Cell (细胞）123,621)。 相信当有义链的裂解被抑制时，靶标mRNA的内切核苷酸裂解会受损 (Leuschner (洛伊什纳）等人（2006)EMB0 Rep. (ΕΜΒ0 报告），7,314 ;兰德等人（2005)细胞 123,621 ;Schwarz (施瓦兹）等人（2004) Curr. Biol.(当代生物学）14, 787)。洛伊什纳等 人证明向有义链中的Ag〇2裂解位点中掺入2' -Ο-Me核糖抑制海拉细胞中的RNAi (洛伊什 纳等人（2006) ΕΜΒ0报告，7, 314)。用硫代磷酸酯修饰观察到类似效果，这显示在哺乳动物 中有效的RNAi也需要有义链的裂解。 Morrissey (莫里西）等人使用了除其他位点和修饰之外还在Ago2裂解位点处包 含V -F修饰的残基的siRNA双链体，并且获得了与未修饰的siRNA相比可相容的沉默 (莫里西等人（2005)H印at〇l 〇gy(肝病学）41，1349)。然而，莫里西的修饰不是基序特异性 的，例如只要嘧啶残基存在，一个修饰便包括在有义链和反义链上的所有嘧啶上的2' -F 修饰，而没有任何选择性；并且因此基于这些教导，有义链的裂解位点处的特异性基序修饰 对基因沉默活性是否具有任何实质作用是不确定的。 Muhonen(穆汉恩）等人使用了在有义链或反义链上的Ago2裂解位点处包 含两个2' -F修饰的残基的siRNA双链体并且发现这被容忍（穆汉恩等人（2007) Chemistry&Biodiversity (化学与生物多样性）4,858-873)。然而，穆汉恩的修饰也是序列 特异性的，例如对于每一具体链而言，穆汉恩仅修饰所有的嘧啶或所有的嘌呤，而没有任何 选择性。 Choung(庄）等人使用了包含替代性修饰的siRNA双链体，通过Y -OMe或 2' -F、2< -OMe和硫代磷酸酯修饰的不同组合以将血清中的siRNA稳定为Surl0058(庄等 人（2006) Biochemical and Biophysical Research Communications (生物化学和生物物 理研究通讯）342,919-927)。庄建议为了增加 siRNA的稳定性不应该用W -〇Me修饰反义 链的裂解位点处的残基。 因此对用于改进siRNA基因治疗的基因沉默疗效的iRNA双链体试剂存在持续的 需要。本专利技术即针对这一需要。 概述 本专利技术提供了针对任选地结合至至少一个配体的dsRNA试剂的有利抑制靶基因 表达的有效的核苷酸或化学基序，以及适于治疗使用的RNAi组合物。 诸位专利技术人出人意料地发现：在由修饰的有义链和反义链组成的dsRNA试剂的裂 解位点处或附近引入一个或多个在三个连续的核苷酸上具有三个相同修饰的基序会增强 该dsRNA试剂的基因沉默活性。 在一个方面中，本专利技术涉及一种能够抑制靶基因的表达的双链RNAi (dsRNA)试 齐[J。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该dsRNA双链体 由式（III)表示： 有义链：5，np-Na- (XXX)「Nb-YYY-Nb- (ZZZ) rNa-n(13， 反义链：3，np'-Na'-(X，X，X，）k-N/ -Y，Y，Y，-Nb'-(Z，Z，Z，） l_Na，_nq ' 5， (III)， 在式（III)中，i、j、k、以及1各自独立地是0或1 ;p和q各自独立地是0-6 ;n表 示一个核苷酸；每个Na和独立地表示一个包括0-25个被修饰或未被修饰或其组合的 核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；每个Nb和N/独立地 表示一个包括0-10个被修饰或未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；每个n p和η, 独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；并且XXX、ΥΥΥ、ΖΖΖ、Χ' X' X'、 Υ' 、以及Ζ' Ζ' Ζ'各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰 的基序；其中Nb上的修饰不同于Υ上的修饰并且Nb'上的修饰不同于Υ'上的修饰。至少 一个Y核苷酸与其互补Y'核苷酸形成一个碱基对，并且其中Y核苷酸上的修饰不同于Y' 核苷酸上的修饰。 每个np和η,独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；每个η和 η'表不一个突出端核苷酸；并且ρ和q各自独立地是0-6。 在另一个方面中，本专利技术涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA 试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少两个在三个 连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或 附近并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该基序分开的该链 的另一个部分处。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序， 其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或附近并且至少一个基序出现在由至少一 个核苷酸在裂解位点处或附近将其与该基序分开的该链的另一个部分处。出现在该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi试剂，包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，其中该双链体由式(III)表示：有义链：5′np‑Na‑(XXX)i‑Nb‑YYY‑Nb‑(ZZZ)j‑Na‑nq3′反义链：3′np’‑Na’‑(X’X′X′)k‑Nb’‑Y′Y′Y′‑Nb’‑(Z′Z′Z′)l‑Na’‑nq’5′(III)其中：i、j、k以及l各自独立地是0或1；p和q各自独立地是0‑6；每个Na和Na′独立地表示一个包括0‑25个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸，每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0‑10个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；每个np、np’、nq以及nq’独立地表示一个包括0‑6个核苷酸的突出端核苷酸序列；并且XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且其中Nb上的该修饰不同于Y上的该修饰并且Nb′上的该修饰不同于Y′上的该修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·G·拉杰夫，T·齐默尔曼，M·马诺哈伦，M·梅尔，S·库奇曼奇，K·查里斯，
申请(专利权)人：阿尔尼拉姆医药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US