陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用，微卫星位点包括12个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12所示。所述的陈氏新银鱼微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：36所示。本发明专利技术公开了陈氏新银鱼的12条微卫星序列及12对微卫星引物。这些位点在对陈氏新银鱼的保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用。

【技术实现步骤摘要】
陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及的是陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用。
技术介绍
陈氏新银鱼(Neosalanxtangkahkeii)属于胡瓜鱼目新银鱼属，又称为太湖新银鱼、近太湖新银鱼，它是中国的特有物种，分布于长江中下游，包括其支流和附属湖泊。陈氏新银鱼是我国的传统经济鱼类，尤其是淡水鱼类这一块。但是，由于水体污染、过度捕捞，以及生境改变等原因，导致陈氏新银鱼的数量大大减少，所以对陈氏新银鱼的保护工作刻不容缓。近年来，微卫星标记在种群结构的研究中发挥了很大的作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用。本专利技术的技术方案如下：陈氏新银鱼微卫星位点，包括12个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQIDNO：1-SEQIDNO：12所示。所述的陈氏新银鱼微卫星位点的引物，其序列分别如SEQIDNO：13-SEQIDNO：36所示。所述的陈氏新银鱼微卫星位点或者所述的引物的应用，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述12个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。本专利技术公开了陈氏新银鱼的12条微卫星序列及12对微卫星引物。这些位点在对陈氏新银鱼的保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用。附图说明图1为陈氏新银鱼模板；1-8：陈氏新银鱼基因组DNA抽提结果；M：Trans2KDNAMarker；Y：空白对照；图2为陈氏新银鱼菌落PCR；1-24：部分菌落PCR结果，其中8、11、13、15、19、21为阳性重组子；M：Trans2KDNAMarker(同图1)；图3为陈氏新银鱼微卫星扩增抽检结果；1-8：部分微卫星位点扩增结果；M：Trans2KDNAMarker(同图1)；具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。1、DNA抽提利用肌肉或者血液组织，提取陈氏新银鱼的基因组DNA。基因组DNA的抽提采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径(Sambrooketal.，1999)，见图1。2、陈氏新银鱼微卫星富集文库的筛选酶切连接利用提取基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切，然后与Sau3AI的接头(A)5’-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT/(B)3’-CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG进行连接。陈氏新银鱼基因组PCR文库的构建将消化产物稀释十倍以后，用连有接头的DNA片段作为模板，寡聚核苷酸链B为引物，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。程序为94℃预变性5min，94℃30sec，53℃1min，72℃1min，26个循环，最后72℃延伸8min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测。用生物素标记的微卫星探针筛选10μmol/L生物素标记的(AG)8/(AC)8探针，50μmol/L引物(为寡聚核苷酸链B)、20×SSC、10％SDS、ddH2O。将双链DNA片段95℃变性5min，立即加入68℃预热的反应液中，68℃温育1h。杂交过程中平衡磁珠。磁珠的平衡将磁珠(DynalA.S产品)轻轻摇匀，吸出300μl到500μl的硅化离心管中，放在磁力架上1～2min，轻轻吸出上清液。用300μl0.5×SSC洗涤3次后，重悬磁珠于100μl0.5×SSC中，将杂交液加入其中。25℃温育10min，每1～2min轻摇一次。磁珠富集微卫星序列、构建陈氏新银鱼微卫星文库将离心管放置在磁力架上，去除上清。依次用洗液I(6×SSC，0.1％SDS)、洗液II(6×SSC)、洗液III(3×SSC)洗涤磁珠，去除不含有微卫星的序列。洗涤方法：洗液I先在室温静置10min，再在68℃洗2次，每次静置10min；洗液II在室温洗2次，每次静置10min；洗液III在室温洗2次，每次静置10min，即可洗去不含微卫星的序列。然后，加入50μlNaOH于室温下静置20min，释放出含有微卫星序列的单链DNA。取上清加入5.5μlTE，3.25μl乙酸，去除NaOH。恢复双链以捕获的单链DNA为模板，以寡聚核苷酸链B为引物进行双链DNA恢复。PCR反应体积为50μL，反应体系组成为：dNTP5μL，Buffer5μL，rTaq1μL，寡聚核苷酸链BPrimer2μL，磁珠洗脱液5μL。PCR的循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸45sec，进行5个循环；进行另外92℃变性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸55sec的30个循环，72℃延伸10min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。质粒连接和转化将3μLPCR产物同1μLT-载体(PEASYTM-T1simplecloningvector)连接，同时T载体自身连接作为对照。加入50μL感受态细胞DH5α进行转化，将已转化的感受态细胞涂布于添加0.5mMIPTG和0.5μg/mLX-Gal的Amp+LB平板上，在37℃下培养13h，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计挑取白色饱满的菌落置于Amp+LB液体培养基中扩大培养(37℃，5h)。采用三引物PCR法(Zaneetal.，2002)检测含有微卫星片段的阳性重组子。实验中选用M13载体通用引物(M13-47)和克隆对应的无生物素标记的探针(AC)8/(AG)8进行反应。如果产物出现两条或两条以上的条带即可认为该单克隆含有目的序列，反之则认为无目的序列。通过三引物法成功检验出有目的序列的阳性重组子97个，对这些重组子进行测序。4、序列分析、引物设计及微卫星位点的初步筛选检查测序结果，去除M13的载体序列后，使用TRF软件(TandemRepeatsFinder，Version3.2.1)寻找其中含有微卫星重复单元的序列(Benson，1999)。使用PRIMER5软件(Lalitha，2000；Singhetal.，1998)在重复单元序列上、下游的侧翼序列中设计引物，将目的片段设置为100-200bp之间。共选择15个微卫星重复位点作为备选标记，部分扩增产物凝胶电泳结果见图3。5、基因分型数据的读取和微卫星位点的获得对初选出的15个微卫星位点的单侧引物5’端进行荧光标记(FAM/HEX/TAMRA)，然后使用24个陈氏新银鱼个体的DNA对上述微卫星位点进行扩增筛选，过程如下：首先对待选位点的PCR扩增，循环设置为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，Tm温度下退火60sec，72℃延伸60sec，反应30个循环；72℃延伸10min。扩增产物使用Tamara350荧光分子量标准在ABI377DNA测序仪中使用聚丙烯酰胺凝胶进行基因分型，基因分析的结果使用Genescan2.0软件进行读取。基因分型结果的分析，去除下列备选位点：无基因分型结果的位点；在任一个体中等位基因数在两个以上的位点；在24个野生陈氏新银鱼中等位基因在两个以下的位点。经过筛选后，最终获得12个稳定的微卫星位点，微卫星序列如下所示：NT-I-13TAACACAAAGAAACTCAAAGTGAAGACGGTAATTGATA本文档来自技高网...

【技术保护点】
陈氏新银鱼微卫星位点，包括12个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：12所示。

【技术特征摘要】
1.陈氏新银鱼微卫星位点序列的核苷酸，包括12个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQIDNO：1-SEQIDNO：12所示。2.根据权利要求1所述的陈氏新银鱼微卫星位点序列的核苷酸的引物，其序列分别如SEQIDNO：13-SEQIDNO：36所示。3.权利要求1所述的陈氏新银鱼微卫星位点序列的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，张保卫，张洁，丁梅，
申请(专利权)人：王慧，
类型：发明
国别省市：安徽;34