钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法技术

本发明专利技术涉及一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，属于生物技术领域。具体步骤是分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即对照组(不施钾组)和处理组(施钾组)，施钾组所施钾肥为硫酸钾。处理的马铃薯植株包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理。对桃蚜种群数量观察记录，并测定不同马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂活性以及与抗虫相关的酶活性。6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，对此利用iTRAQ技术研究不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制。本发明专利技术充分发挥马铃薯的自然抗性和诱导抗性，揭示了钾肥增强马铃薯的抗虫机理，对开展蚜虫生态调控具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法
本专利技术涉及一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，属于生物

技术介绍
马铃薯(Solanumtuberosum)是世界第四大作物，也是内蒙古自治区重要的高产粮蔬兼用优势作物，在国民经济的各个方面具有重要意义。作为“中国马铃薯之都”的乌兰察布市是全国重要的马铃薯种植、生产和加工基地。作为食用鲜薯、种薯和加工原料薯的马铃薯产品远销国内和东南亚各国，成为该市农民脱贫致富、建设新农村的支柱产业。马铃薯产量和品质受到品种、施肥、气候和病虫害等多种因素的综合影响，其中桃蚜(Myzuspersicae)是马铃薯田最常见的虫害之一，成虫和若虫群集在叶片和嫩茎上，吸食植物体内的汁液，使植株生育不良。蚜虫还能传播多种马铃薯病毒和纺锤块茎类病毒，严重影响马铃薯的产量和质量。虽然有关研究报道很多，防治方法手段多样，但从施肥提高作物长势、增加作物产量、减轻病虫害的角度来研究作物抗虫的机理较少，以至对作物生态系统中自然因素的调控作用仍不清楚，作物的自然抗性、诱导抗性未能充分发挥，目前仍以化学防治为主。此法不仅增加了投资和环境污染，同时也使害虫的抗药性不断提高，农药的有效性降低。此外，害虫的天敌也受到毒害，严重破坏了农业生态系统的平衡。诱导抗虫性在植物防御害虫中发挥着重要作用。目前，国内外植物诱导抗性研究报道较多，主要包括树木、小麦、水稻等植物。其研究内容包括植物信号物质的研究、植物次生物质在抗虫中的作用等，如棉花受到虫害取食后，受伤部位能够释放出许多诱导的挥发性萜类和绿叶挥发物；马铃薯叶片气味的存在利于马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)进行寄主定位，将该幼虫反吐物涂于叶片表面，则受伤叶和对照叶中均会产生乙烯；过氧化物酶和多酚氧化酶的活性也显著提高，茉莉酸处理的马铃薯对蚜虫(Phytophthorainfestans)的抗性显著增强。但采用蛋白组学研究施钾条件下马铃薯抗虫蛋白的表达未见报道。仅在水稻研究中表明P40与水稻受褐飞虱为害后引起的应答有关。植物的抗虫能力与其营养密切关系。麦二叉蚜明显嗜好缺氮营养的植株，油松施氮后不仅树势增强，且对刺吸类、松梢螟等害虫也有明显抑制作用；适量供钾可增加小麦植株对钾素的吸收，促进了植株生长和总酚、酚酸、木质素的合成及代谢相关酶的活性，增强小麦对蚜虫的抗性。钾是人们公认的“钾似农药”，在马铃薯块茎形成以及提高其抗性中有着特殊的作用。因为钾是植物必需的大量营养元素，以离子形态存在于植物体内，具有相对稳定的高浓度和强移动性，植物的新陈代谢、生长和抗逆反应完全依赖于钾在细胞中实现。研究表明，外源钾的供应影响体内4种主要功能基因的转录，包括与激素茉莉酸有关的基因、编码细胞壁蛋白的基因、参与运输过程的基因和与细胞信号转导有关的功能基因。钾饥饿会导致细胞缺乏足够的渗透势而使植物生长延缓，同时也抑制了光合作用、蛋白质合成及长距离运输，使N/C失衡。钾在防御和次生代谢中介导的转录也和茉莉酸信号有关。多数基因在钾饥饿时显示出典型的上游调节，而在重新供钾时表现为下游调节。最典型的基因调节是编码多聚半乳糖醛缩酶抑制蛋白、天门冬酸蛋白酶、蛋白酶抑制剂和几种与FAD相关的氧化还原酶。已有研究显示，钾介导的转录和茉莉酸相关，它们是茉莉酸合成途径中的组分或者是合成过程中必需的。外源钾浓度的改变，通过植物体内钙等信号激活茉莉酸代谢途径，使茉莉酸类合成加速，植物的抗虫性提高。综上所述，钾在茉莉酸信号网络中有着重要的作用。尽管茉莉酸信号与马铃薯抗虫的关系已有一些研究，但系统地把钾肥营养与虫害后马铃薯茉莉酸信号传递结合起来，通过研究马铃薯对外界钾浓度变化的感知及对茉莉酸合成的影响，进而调节其蛋白表达的研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，从马铃薯施钾与其诱导抗性的关系出发，以便更好地探讨施钾对马铃薯体内抗虫蛋白表达的调节机理。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下。一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，具体包括以下步骤：(1)分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即对照组(不施钾组)和处理组(施钾组)，施钾组所施钾肥为硫酸钾，其用量按最低施钾量75000株/公顷马铃薯计算。每组分为4个施钾水平，所施硫酸钾分别为0(CK)、4、6和8g/株。(2)自然条件下生长2个月后，随机选取一半对照组和处理组植株，在每株上接桃蚜5头，接虫枝用80目的纱网罩住，以防止昆虫迁出。上述处理中，除0g/株仅为对照和接虫两种处理外，其余3种施钾水平处理的马铃薯植株则包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理。每组处理重复20次。在此期间，对桃蚜种群数量进行观察记录，并测定不同处理马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂(PI)活性以及一些与抗虫相关的酶活性，如脂氧合酶(LOX)活性、过氧化物酶(peroxidase，POD)等变化。(3)针对结果分析比较发现，6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，故在上述研究的基础上，利用iTRAQ技术研究了不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，从一个侧面阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制，为桃蚜的综合防治提供科学依据。步骤(3)中，蛋白的提取和鉴定过程如下：(1)蛋白的提取与消化：采用丙酮沉淀法提取蛋白。其过程大致为：分别取上述四种处理的马铃薯植株叶片，加入TCA-冰丙酮冰浴研磨，-20℃沉淀2h，4℃、30000g离心30min。取沉淀，再加入预冷的纯丙酮清洗沉淀，-20℃沉淀30min，4℃、20000g离心30min。取部分沉淀加入1.5mL离心管中(加至0.1～0.5的刻度之间即可)，加入配置好的SDS复溶Buffer，超声5min助溶，离心25min，取上清100μL，加入DTT至终浓度10mmol/L。56℃水浴1h。迅速加入IAM至终浓度55mmol/L，暗室静置1h。加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20℃沉淀3h。4℃20000g离心20min，取沉淀。加入50μL的1％SDS复溶沉淀，用水稀释至250μL，超声3min助溶。使用2D-QuantKit定量。每个样品取100μg体积，加入等体积的纯TEAB(即水∶TEAB＝1∶1)，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积。加入1μg/μL的Trypsin，每100μg蛋白质底物加入3.3μg的酶，37℃水浴24h，然后补加Trypsin1μg。37℃12h。冻干消化液，然后使用TEAB(水∶TEAB＝1∶1，含0.1％SDS)每管50μL复溶肽段。取1μL消化后肽段，使用MALDITof/Tof检测消化效率。(2)iTRAQ试剂标记肽段：标记试剂平衡至室温。每管标记试剂中加入70μL异丙醇，混匀，离心甩至管底。将混好的标记试剂加入到肽段中，混匀后甩至管底，室温静置2h。MALDI检测标记效率。(3)micro-Tof-Q检测肽段信号：标记后样品稀释后调pH至3.0，用0.22μm有机膜过滤。经排气、清洗、平衡至压力后，即可在HPLC(强阳离子交换色谱)中上样。收集样品。通过C18反相色谱除盐。20μL0.1％甲酸复溶。取0.8μL样品点靶，LC-MS/MS分析。根据分析结果，masc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即对照组(不施钾组)和处理组(施钾组)，施钾组所施钾肥为硫酸钾，其用量按最低施钾量75000株/公顷马铃薯计算；每组分为4个施钾水平，所施硫酸钾分别为0(CK)、4、6和8g/株；(2)自然条件下生长2个月后，随机选取上述一半对照组和处理组植株，在每株上接桃蚜5头，接虫枝用80目的纱网罩住，以防止昆虫迁出；上述处理中，除0g/株仅为对照和接虫两种处理外，其余3种施钾水平处理的马铃薯植株则包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理；每组处理重复20次；在此期间，对桃蚜种群数量进行观察记录，并测定不同处理马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂(PI)活性以及一些与抗虫相关的酶活性，如脂氧合酶(LOX)活性、过氧化物酶(peroxidase，POD)的变化；(3)针对上述结果分析比较发现，6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，故在上述研究的基础上，利用iTRAQ技术研究不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制。

【技术特征摘要】
1.一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即不施钾组的对照组和施钾的处理组，施钾组所施钾肥为硫酸钾，其用量按最低施钾量75000株/公顷马铃薯计算；每组分为4个施钾水平，所施硫酸钾分别为0、4、6和8g/株；S2、自然条件下生长2个月后，随机选取一半对照组和处理组植株，在每株上接桃蚜5头，接虫枝用80目的纱网罩住，以防止昆虫迁出；上述处理中，除0g/株仅为对照和接虫两种处理外，其余3种施钾水平处理的马铃薯植株则包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理；每组处理重复20次；在此期间，对桃蚜种群数量进行观察记录，并测定不同处理马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂(PI)活性以及一些与抗虫相关的酶活性；S3、针对结果分析比较发现，6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，故在上述研究的基础上，利用iTRAQ技术研究不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制，蛋白的提取和鉴定过程如下：(1)蛋白的提取与消化：采用丙酮沉淀法提取蛋白，其过程大致为：分别取上述四种处理的马铃薯植株叶片，加入TCA-冰丙酮冰浴研磨，-20℃沉淀2h，4℃、30000g离心30min，取沉淀，再加入预冷的纯丙酮清洗沉淀，-20℃沉淀30min，4℃、20000g离心30min，取部分沉淀加入1.5mL离心管中，加至0.1～0.5的刻度之间即可，加入配置好的SDS复溶Buffer，超声5min助溶，离心25min，取上清100μL，加入DTT至终浓度10mmol/L，56℃水浴1h，迅速加入IAM至终浓度55mmol/L，暗室静置1h，加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20℃沉淀3h，4℃20000g离...

【专利技术属性】
技术研发人员：任琴，白雪，马晓林，徐松鹤，杨晓红，
申请(专利权)人：集宁师范学院，
类型：发明
国别省市：