本发明专利技术公开了一株分离于法国干香肠且具有优良发酵特性的模仿葡萄球菌L-RG18(Staphylococcus simulans L-RG18)的高密度发酵技术，包括发酵培养基和发酵工艺条件优化控制，以及重复分批耦合细胞循环的高密度培养模式。通过本发明专利技术可以得到活菌数为3.72×1011CFU/mL的高密度发酵液。以上高密度发酵技术为进一步研究制备直投式模仿葡萄球菌肉用发酵剂鉴定了基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一株分离于法国干香肠且具有优良发酵特性的模仿葡萄球菌L-RG18(Staphylococcus?simulans?L-RG18)的高密度发酵技术，包括发酵培养基和发酵工艺条件优化控制，以及重复分批耦合细胞循环的高密度培养模式。通过本专利技术可以得到活菌数为3.72×1011CFU/mL的高密度发酵液。以上高密度发酵技术为进一步研究制备直投式模仿葡萄球菌肉用发酵剂鉴定了基础。【专利说明】一种肉用模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基及其高密度培养方法
本专利技术涉及微生物发酵
，特别涉及肉用发酵剂模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基、培养条件以及高密度培养方法。
技术介绍
葡萄球菌是发酵肉制品生产中一类重要的微生物。在肉制品发酵过程中，它能产生硝酸盐和亚硝酸盐降解酶，从而使肉呈现鲜艳的玫瑰红色，一些葡萄球菌还能产生H2O2酶，不仅有利于发酵香肠护色，还能对抑制腐败起到重要作用。此外，它们能产生降解蛋白质和脂肪的酶，酶解产物在干发酵香肠特征风味形成中起了重要作用。筛选具有优良发酵特性的葡萄球菌，并通过将其制备成直投式发酵剂在生产中大规模应用是目前的研究重点。国外开发的商业肉品发酵剂仅有木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌(Cocolinet al.，Applied and environmental microbiology, 2006, 72(1):942-945;Corbiere etal., Journal of applied microbiology, 2007，102 (I): 238-244),而我国对葡萄球菌发酵剂研究还处于菌种的选择和筛选阶段，对其工业化生产技术即高效发酵剂制备技术研究还鲜见报道。国内孔保华等人研究了木糖葡萄球菌的发酵方法(201110258768.5，木糖葡萄球菌A2的高密度培养的培养基及培养方法)，但仍然采用培养基成分优化基础上的分批培养方式，此法虽然简单，但所得的菌体密度不高，只有约109CFU/mL。利用高密度培养得到高浓度细胞培养物是制备高效发酵剂的基础。常见的高密度培养方法有补料分批培养、固定化细胞培养等。近年来，随着膜技术的发展，越来越多的研究运用膜从培养基中分离微生物细胞。典型的膜生物反应器包括一个连续培养发酵罐和一个错流过滤膜组件，从而保证持续的细胞循环并排除代谢产物。在这样的循环系统中，细胞浓度能达到很高的水平。膜细胞循环发酵在一些微生物初级及次级代谢产物发酵中得到了有效应用，例如乳酸，木糖醇，乙醇的生产(Nishiwaki et al., Biochemical EngineeringJournal.1999, 4:37-44;Oh et al., Applied Biochemistry And Biotechnology.2003, 107:603-613;Roca et al., Applied Biochemistry And Biotechnology.2003, 60:560-563)另外，重复分批发酵能节省发酵中因清洗、灭菌和接种而耗费的时间，在一些酵母菌代谢产物发酵中得到了有效应用(Koh et al.,Biotechnology Letters.2003, 25:2103-2105;Rymowicz et al., Applied Biochemistry And Biotechnology.2010，87:971-979)。利用膜细胞循环耦合重复分批发酵能结合两者发酵方式的优点，提高发酵罐菌体密度、缩短生产周期、减轻下游细胞分离难度，从而提高生产效率，但利用此方法对模仿葡萄球菌进行高密度培养还未见报道。本专利技术针对一株从法国干香肠中分离得到且具有较强的硝酸还原酶能力、产过氧化氢酶能力、水解干酪素、脂肪和脱脂奶粉能力，耐NaNO2、耐盐性能优良的模仿葡萄球菌L-RG18，通过优化液体发酵培养基及培养条件，并对其高密度培养方法进行研究，旨在提高发酵液中模仿葡萄球菌活菌密度，为进一步制备其直投式发酵剂奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18优化发酵培养基配方。本专利技术的另一目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18优化发酵条件。本专利技术的另一目的在于提供模仿葡萄球菌L-RG18高密度培养方法。所述的模仿葡萄球菌L-RG18为本专利技术人从法国干香肠(Justin Bride)中分离并鉴定的菌种。经研究表明，它具有较强的硝酸还原酶能力、产过氧化氢酶能力、水解干酪素、脂肪和脱脂奶粉能力，耐NaNO2、耐盐性能优良，是一株可以选作肉用发酵剂的优良菌株本专利技术的目的是通过如下技术方案实现:本专利技术提供一种模仿葡萄球菌L-RG18发酵培养基,其主要成分、含量及培养基配置条件如下:基础培养基，蜂蜜6-10g/L、番茄汁10-20g/L、，玉米浆5-7g/L，再使用中和剂调节PH值至7.0-7.6，121°C灭菌20分钟。其中，番茄汁、蜂蜜、玉米浆制备方法如下:蜂蜜制备工艺:取市售洋槐蜂蜜，无菌水稀释10倍后用0.22 μ m滤膜过滤除菌，4 °C保存备用。番茄汁制备工艺:将番茄用清水洗净，将其放入90_95°C水中热烫3min，用番茄打浆机打浆，然后用8层纱布过滤，将滤液于100°C灭菌15min，冷却后4°C保存备用。玉米浆制备工艺:取市售玉米浆，无菌水稀释10倍后用0.22 μ m滤膜过滤除菌，4 °C保存备用。根据本专利技术的一种优选方式，所述基础培养基为生长培养基，其配方为:酪蛋白胨10g/L，牛肉浸膏lg/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾3g/L。根据本专利技术的一种优选方式，所述的蜂蜜、番茄汁、玉米浆添加量分别为8.75g/L、14.97g/L、5.96g/L。根据本专利技术的一种优选方式，所述中和剂调节pH值为7.4，中和剂为lmol/LNaOH。其次，本专利技术涉及一种模仿葡萄球菌L-RG18高密度培养方法，其主要步骤如下:(1)种子培养液的制备:将冷冻保存的模仿葡萄球菌L-RG18菌粉接种于发酵培养基试管中，28-34°C摇床培养18-20h，摇床转速为140_230rpm/min，以1%接种量在试管中连续活化三代，然后以1%接种量接种于三角瓶中，28-34°C，140-230rpm/min培养18_20h制得种子培养液。(2)细胞循环培养:将种子培养液以0.5-1%接种量接种于5L发酵罐中，发酵罐工作体积为3L，培养温度28-34°C，转速140-230rpm/min，微通空气。通过流加一定浓度中和剂维持发酵液PH为7.0-7.6。在发酵至菌株生长对数末期开始第一次细胞循环，即泵出一定体积发酵液，同时泵入同体积新鲜培养基以维持发酵液体积恒定，周期性循环若干次后继续培养至发酵液活菌数不再增加时停止发酵。根据本专利技术的一种优选方式，所述步骤(1) (2)中培养温度为30°C，转速为200rpm/mino所述步骤(1)中三角瓶体积为500mL，装液量为100_150mL。根据本专利技术的一种优选方式，所述步骤(2)中维持发酵液pH值为7.4，所使用的中和剂为 4mol/L NaOH0所述步骤(2)中微通空气是以1.2-1.8NL/min流量通入无菌空气。所述步骤(2)中菌株生长对数末期为发酵第8h，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于模仿葡萄球菌L‑RG18的发酵培养基，其特征在于所述培养基配置方法如下：在基础培养基中添加蜂蜜6‑10g/L、番茄汁10‑20g/L、玉米浆5‑7g/L，再使用中和剂调节pH值至7.0‑7.6，121℃灭菌20分钟。其中,蜂蜜、番茄汁、玉米浆制备方法如下：蜂蜜制备工艺：取市售洋槐蜂蜜，无菌水稀释10倍后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。番茄汁制备工艺：将番茄用清水洗净，将其放入90‑95℃水中热烫3min，用番茄打浆机打浆，然后用8层纱布过滤，将滤液于100℃灭菌15min，冷却后4℃保存备用。玉米浆制备工艺：取市售玉米浆，无菌水稀释10倍后用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李平兰，桂萌，张晓琼，马长伟，王洋，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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