本发明专利技术涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌外植体的获得：取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；（2）发根农杆菌工程菌液的制备；（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生。本发明专利技术提供了一种高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，并对获得的甘草毛状根选用适当的液体培养基进行悬浮培养并应用于生产药用次生代谢产物（甘草苷和甘草酸等）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种采用发根农杆菌侵染乌拉尔甘草幼苗茎节诱导产生毛状根的方法，并用此毛状根生产药用次生代谢产物，例如甘草苷和甘草酸等，尤其是高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法及用毛状根生产甘草次生代谢产物的方法。
技术介绍
乌拉尔甘草(Glycyrrihiza uralensisi Fisch.)是我国重要的传统中药,具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃等功效，被誉为“百草之王”，其药用价值是其它资源不能替代的。甘草的主要药效成分包括甘草酸和甘草苷，其中甘草酸是非常珍贵的解毒齐?，可防治病毒性肝炎、高血脂和癌症等疾病；甘草黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗衰老和保肝等药理作用，此外，甘草不仅是重要的药材，还广泛应用于日用化工品及食品领域，其中甘草酸还是一种天然甜味剂，甘草苷是一类天然抗菌剂和防腐剂。随着甘草资源的不断开发与利用，国内市场甘草的需求总量为9.0万~10.0万吨，但全国甘草总量只有2.5万~3.0万吨，资源短缺已趋白热化，严重影响了医药企业的生产。2001年9月，我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，使甘草资源缺乏加剧，目前人工栽培仍是甘草生产的主要途径，然而，人工栽培周期长，并且受地域限制，特别是在有效成分含量上，人工种植甘草与野生甘草还存在很大的差距，还不能满足市场需求。人工栽培的甘草中的甘草酸含量基本在2%以下，较野生甘草的平均值低30~40%，达不到我国药典2%的最低要求，甘草资源匮乏及其质量下降成为限制甘草资源深度开发利用的瓶颈。 随着生物工程技术的不断提高,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导药用植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，迅速大量提取有效成分，是药用植物资源可持续发展的有效途径之一。毛状根培养技术是20世纪80年代后期在植物细胞领域发展起来的一项新技术，与一般的植物细胞培养相比，毛状根可以生长在不含激素的培养基上。这一培养系统对传统药材来说很重要，因为约1/3的传统中药材是植物的根部，曾经被认为难以通过细胞培养来生产的许多源于植物根部的药物，现在正被设法通过培养毛状根来生产，发根农杆菌Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，活性成分含量高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景；目前，关于乌拉尔甘草毛状根培养的研究并不多，大部分报道的毛状根诱导方法都是采用离体子叶节、子叶、下胚轴进行毛状根诱导。但目前所公开的乌拉尔甘草毛状根诱导培养都采用离体组织进行遗传转化，因此诱导率相对较低，并且获得的毛状根大量携带农杆菌，除菌比较困难，不利于继续进行毛状根悬浮培养，实际应用价值不大，无法满足生产需求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，能够高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根的产生；本专利技术的目的之二是提供一种用上述乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，能够得到生产甘草苷、甘草酸的原料，生产出甘草苷、甘草酸。—种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特别之处在于，包括如下步骤:(I)无菌外植体的获得:取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12~15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；(2)发根农杆菌工程菌液的制备:取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液OD6tltl值为0.6~0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液OD6tltl值为0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100~150 μ M，制成工程菌液待用；(3)针刺幼苗茎节诱导毛状根产生:按照步骤(1)中获得的外植体，经步骤(2)中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h~48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10~15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。步骤(3)中针刺幼苗茎节诱导毛状根产生的具体步骤为:用注射器针头蘸取制备好的发根农杆菌工程菌液，在处理好的外植体即无菌甘草幼苗的子叶节处穿刺1-2次，将穿刺过的外植体置无菌滤纸上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培养基中，置25土 1°C下共培养2~3天，然后转移到含头孢霉素300~500mg/L的Ms培养基中，培养10-15天即可在子叶节处出现白色凸起，3~5天后在凸起处长出簇状绒毛根系。步骤(1)中幼苗培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中蔗糖至30g/L，琼脂粉至5.5g/L，无激素；步骤(2)中的Ms液体培养基是在MS培养基的基础上去掉了琼脂。步骤(2)中发根农杆菌为含有Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834。步骤(2 )中YMB液体培养基的成分为酵母抽提物1.0g/L, MgSO4.7H200.2g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl0.1 g/L,甘露醇 10.0g/L。步骤(3)中共培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中琼脂粉至5.5g/L，蔗糖至30.0g/L,乙酰丁香酮至50~100 μ M ;步骤(3)中抑菌培养基采用l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且添加头孢霉素300mg/L~500mg/L。其中置25±1°C共培养2~3天的同时应处于弱散射光条件下。一种利用乌拉尔甘草毛状根生产甘草次生代谢产物的方法，其特别之处在于，包括如下步骤:剪取权利要求1或2中所述方法得到的毛状根，长度约1.5~2.0cm，接种到含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基进行除菌培养，每5~7天转入新的l/2Ms培养基，直至除菌完毕，将得到的无菌毛状根根尖剪成1.0-1.5cm的段，接种于无激素的l/2Ms液体培养基中，置25 ± I °C，转速110~120rpm，暗培养条件下的恒温振荡器上振荡培养15~20天，收集毛状根，冷冻干燥后粉碎成100~200目粉末即可。从得到的甘草毛状根粉末中提取出甘草酸、甘草苷。其中含有头孢霉素100~300mg/L的l/2Ms培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基,并且添加头孢霉素100~300mg/L ;其中无激素的l/2Ms液体培养基，即在MS培养基的基础上其中的大量兀素和微量兀素添加量为Ms培养基的一半,铁盐和有机成分含量同Ms培养基，并且去掉了琼脂也无激素。针对目前存在的乌拉尔甘草野生药用资源的严重短缺，而人工栽培甘草品质难以达到药用标准的困境，本专利技术提供了一种高效、稳定诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，并对获得的甘草毛状根选用适当的液体培养基进行悬浮培养并应用于生产药用次生代谢产物(甘草苷和甘草酸等)。本专利技术首次以乌拉尔甘草活体幼苗为受体材料，采用“针刺幼苗茎节法”，即用蘸有发根农杆菌工程菌液的针尖穿刺侵染乌拉尔甘草幼苗茎节处，快速诱导乌拉尔甘草毛状根产生，既缩短了甘草毛状根产生时间，诱导培养7天就出现毛状根，又提高了转化率，达98%以上，同时减少了毛状根除菌次数(经2次除菌培养即可)，并且，毛状根中活性成分甘草苷含量高较本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌外植体的获得：取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12～15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体；（2）发根农杆菌工程菌液的制备：取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液OD600值为0.6～0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液OD600值为0.6～0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100～150μM，制成工程菌液待用；（3）针刺幼苗茎节诱导毛状根产生：按照步骤（1）中获得的外植体，经步骤（2）中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h～48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10～15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。
【技术特征摘要】
1.一种高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)无菌外植体的获得: 取乌拉尔甘草种子，灭菌后接种于幼苗培养基进行培养，获得株龄12~15d的无菌幼苗，切除根部后作为外植体； (2)发根农杆菌工程菌液的制备: 取含有Ri质粒的发根农杆菌，经活化培养，挑取单菌斑接种于YMB液体培养基培养至菌液0D_值为0.6~0.8，离心后弃上清液，加入等体积Ms液体培养基稀释至菌液0D_值为0.6~0.8，添加乙酰丁香酮至终浓度为100~150 μ M，制成工程菌液待用； (3)针刺幼苗茎节诱导毛状根产生: 按照步骤(1)中获得的外植体，经步骤(2)中获得的工程菌液进行农杆菌介导转化，再将介导转化过的外植体接种于共培养基中，培养24h~48h，然后将外植体接入抑菌培养基中，除菌培养10~15d，直至在外植体上子叶茎节处长出毛状根。2.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(3)中针刺幼苗茎节诱导毛状根产生的具体步骤为:用注射器针头蘸取制备好的发根农杆菌工程菌液，在处理好的外植体即无菌甘草幼苗的子叶节处穿刺1-2次，将穿刺过的外植体置无菌滤纸上吸去多余的菌液，然后移栽到不含激素和抗生素的Ms培养基中，置25土1°C下共培养2~3天，然后转移到含头孢霉素300~500mg/L的Ms培养基中，培养10-15天即可在子叶节处出现白色凸起，3~5天后在凸起处长出簇状绒毛根系。3.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(1)中幼苗培养基采用Ms培养基；或者采用MS培养基，并且调整其中蔗糖至30g/L，琼脂粉至5.5g/L，无激素；步骤(2)中的Ms液体培养基是在MS培养基的基础上去掉了琼脂。4.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(2)中发根农杆菌为含有Ri质粒的发根农杆菌ATCC15834。5.如权利要求1所述的高效诱导乌拉尔甘草毛状根产生的方法，其特征在于:步骤(2)中YMB液体培养基的成分为酵母抽提物1.0g...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭生虎，王敬东，马洪爱，石磊，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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