截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。本发明专利技术提供了tATA4片段，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。本发明专利技术提供的tATA4片段可以作为抵抗相思子毒素攻击的疫苗的活性成分。本发明专利技术具有重大的应用价值和深远的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用
本专利技术涉及截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。
技术介绍
随着生物技术的快速发展和生物毒素的开发利用，毒素在大规模杀伤性武器中的重要性已凸现出来，生物毒素及其生物恐怖的威胁与日俱增。作为B类生物战剂，相思子毒素被列入国际生物战剂核查清单，它和蓖麻毒素在分子结构和作用机制上具有高度相似性，由A-B链结构组成(A链为效应链，具有RNA N-糖苷酶活性；B链为结合链，介导A链进入细胞内发挥毒性作用)。相思子毒素小鼠腹腔LD5tl为0.04 μ g/kg，其毒性是蓖麻毒素的75倍。相思豆主要分布在亚热带地区，在我国的南方有广泛分布，常被用作装饰品的制作，甚至能在淘宝网上都能购买到大量的原料，而且在许多公开的专业刊物和互联网上都可以找到如何提取制备相思子毒素的详细资料，因此其恐怖威胁不容易忽视。尤其是面对东突、疆独、藏独等恐怖极端分子危害人类的恐怖活动新动态，在我国不排除发生相思子毒素的生物恐怖袭击可能性。针对相思子毒素中毒，目前尚无预防疫苗、特异性抗毒素和解毒药。通过分析现有的研究进展和成果，美军的生防专家认为，疫苗研究是对抗其中毒的有效预防手段。因此，开展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的军事和社会意义。我国学者对相思子毒素生物战剂的侦检工作有了初步的发展，而对其疫苗作为医学防护的研究才刚刚起步，针对潜在相思子毒素的恐怖袭击尚无有效的免疫治疗和防护手段，因此迫切需要建立和发展具有自主知识产权的防护用品，保证及时采取应急措施和对策，将生物恐怖袭击造成的破坏降低到最低限度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种截短表达的相思子毒素A链蛋白抗原及其应用。本专利技术提供了一种蛋白质，命名为tATA4片段，是如下(a)或(b)或(C)或(d):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。[0007编码所述tATA4片段的基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的DNA分子:(I)编码区如序列表的序列I所不的DNA分子；(2)序列表的序列I所不的DNA分子；(3)具有序列表的序列I所示的核苷酸序列的DNA分子；(4)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；(5)序列表的序列3所示的DNA分子；(6)在严格条件下与(I)或(2)或(3)或(4 )或(5 )限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(7 )与(I)或(2 )或(3 )或(4 )或(5)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜一次。含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体可为重组表达载体。所述重组表达载体具体可为在pET-His表达载体的多克隆位点(如EcoR I和Nhe I酶切位点之间)正向插入了序列表的序列I所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。本专利技术还保护所述tATA4片段在制备相思子毒素疫苗中的应用。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素_a。本专利技术还保护所述tATA4片段和佐剂在制备相思子毒素疫苗中的应用。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素_a。所述佐剂具体可为铝佐剂。本专利技术还保护一种相思子毒素疫苗，其活性成分为所述tATA4片段。所述疫苗还包括佐剂。所述佐剂具体可为铝佐剂。所述相思子毒素为天然相思子毒素和/或相思子毒素~?ο本专利技术以相思子毒素的A链为基础，从中截取得到了 tATA4片段。与相思子毒素的A链相比，tATA4片段的毒性大幅降低，但保持了良好免疫原性。将tATA4片段免疫动物后，可以保护动物免受相思子毒素的攻击致死作用。综上所述，本专利技术提供的tATA4片段可以作为抵抗相思子毒素攻击的疫苗的活性成分。本专利技术具有重大的应用价值和深远的应用前景。【附图说明】图1为pET-His表达载体的结构示意图。图2为tATA4片段溶液进行15%SDS_PAGE的电泳图谱。图3为tATA4片段和A链蛋白对BEAS-2B细胞的杀伤作用，细胞存活率结果。图4为tATA4片段和A链蛋白对小鼠的毒性，相对体重结果。【具体实施方式】以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。基于大量的序列分析、片段截取、毒性验证和免疫原性验证，本专利技术的专利技术人发现相思子毒素A链中的一个多肽片段兼具低毒性和良好的免疫原性，可以作为相思子毒素的疫苗使用。将该片段命名为tATA4片段，其编码基因如序列表的序列I所示。pET-His表达载体(结构示意图见图1):深圳市源动力生物技术开发公司。大肠杆菌BL21 (DE3):北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为⑶601。BEAS-2B细胞(人肺上皮细胞)=ATCC细胞库，ATCC Number为CRL-9609?。BALB/c小鼠:军事医学科学院动物中心，产品号为RB003。铝佐剂(Imject?铝剂，佐剂)=Thermo scientific公司，产品号为77161。羊抗兔IgG:北京鸿跃创新科技有限公司，产品编号为Hy-5506。相思子毒素-a (abrin-a):以市售的相思豆为原料，参照文献的方法制备得到相思子毒素-a ;参考文献信息:【题名】相思子毒素_a的纯化及鉴定，【作者】李小兵谢光洪周昌芳张志刚宋文学周晓翠张乃生王兴龙高宏伟王哲，【机构】吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062，【刊名】中国兽医学报，2008(3):310-313。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.2、0.01M的PBS缓冲液。实施例1、tATA4片段的制备1、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子(编码序列表的序列2所示的tATA4片段)。2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fl:5，-CCG GAATTC GAAGATCGCCCGATCA-3，； Rl:5’ -CTA GCTAGC ATCCGGCTGAAATGCCGTA-3’。3、用限制性内切酶EcoR I和Nhe I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶EcoR I和Nhe I双酶切pET_His表达载体，回收约2.9kb的载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下:在pET-His表达载体的EcoR I和Nhe I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）具有序列表的序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质,是如下(a)或(b)或(C)或(d): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)具有序列表的序列2所不的氣基酸序列的蛋白质； (c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2或序列4衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的DNA分子: (1)编码区如序列表的序列I所示的DNA分子； (2)序列表的序列I所不的DNA分子； (3)具有序列表的序列I所示的核苷酸序列的DNA分子； (4)编码区如序列表的序列3所示的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王景林，张弢，康琳，高姗，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：