采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法技术

采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测。该法以嗜吞噬细胞无浆体16SrRNA为靶基因位点，具有快速、灵敏、高效、低成本等特点。

【技术实现步骤摘要】
采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及采用环介导等温扩增技术(LAMP)检测嗜吞噬细胞无浆体方法。
技术介绍
嗜吞噬细胞无浆体是立克次氏体目(Rickettsiale)无浆体科(Anaplasmataceae)无衆体属(Anaplasma)的一种重要的人兽共患病原体。该病原体广泛寄生于包括人、野生动物和家畜和啮齿动物的粒细胞内。人粒细胞无浆体病(Humangranulocytic anaplasmosis, HGA)就是由嗜吞卩遼细胞无衆体(A.phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒细胞引起的(Lj Zhang, Y Liu, et al.Nosocomial Transmission of HumanGranulocytic Anaplasmosis in China[J].The Journal of the American Medical Association, 2008，300(19):2263-2270)。目前，无浆体的主要检测方法有病原学诊断、血清学诊断法和分子生物学诊断法等ο病原学诊断主要有血涂片检查和动物接种试验。血涂片检查仍是无浆体检查最为经典的方法，其要求在疑患病动物用药之前体温较高时进行采血做血涂片，用姬姆萨染色法染色，染色后在1000倍油镜下观察结果。该方法虽简单可靠，但在实验过程中需要使用显微镜，对人员要求较高，且检出率低(党志胜，蒋锡仕，黄孝玢.我国牛羊边虫及边虫病的研究现状[J].青海畜牧兽医杂志，2003，33 (4):39-41)。临床上，若被检动物染虫率很低，不能确诊，可通过人工培养病原，接种实验动物来人工感染动物，然后收集接种动物的血液，进行诊断(G Ulrike, Munderloh, M Cynthia, M Lynch, et al.1solation of anAnaplasma sp.0rganism from White-Tailed Deer by Tick Cell Culture[J].Journal ofClinical Microbiology, 2003,41(9):4328-4335)。无浆体的体外培养往往需要较好的实验条件和操作熟练的专业技术人员，因此该方法不适用于田间流行病学调查，而较适合于病原的实验室分离。血清学诊断主要有补体结合试验(CF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。在我国，张其才利用边缘边虫高染虫率的含虫血所制备的补反诊断抗原具有敏感性良好和特异性很强的特点，CF方法对试验条件下人工感染牛的补反检出率为99%，安全区无假阳性反应(张其才，吕文顺，窦惠芳，等.补体结合试验诊断边虫感染牛的研究[J].中国兽医科技.1993,23(5):8-10)。该方法虽然具有其自身的很多优点，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗体的比例适当，否则会出现假阳性或假阴性现象，另外，由于操作条件和技能等较高要求的限制而不适合于田间流行病学调查。2007年Glen等证实了 ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病(Glen A Scoles1WLGoff,TJ Lysykj et al.Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use inthe diagnosis of A.0vis infections in domestic sheep and Anaplasma sp.1n wildungulates [J].Veterinary Microbiology, 2008，130 (1-2): 184-190)。2010 年徐平源等还对湖南地区边缘无浆体的MSP4基因进行了克隆及序列分析，这些都为重组抗原ELISA诊断方法的建立奠定了基础。ELISA多用于样品的批量筛检，且特异性强，但其缺点在于对时间和操作的要求非常严格，必须有专业人员完成，而且对于阳性的区别比较模糊，有时候需要反复做(徐平源，何德肆.湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32(10):815-817)。分子生物学诊断方法主要有核酸探针技术、聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物(如酶与荧光素等)标记的DNA片段、单链DNA和RNA等。其具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段结合，可用于样品中特定基因片段的检测。中国研究者马米玲等的研究表明，核酸探针技术的最大优点是可以较准确的区分形态相似的病原，但与病原学检查和血清学方法相比，其敏感性并不具有明显的优势，而且需要特殊设备，检出速度又慢，不适应于大批量样品的检测(马米玲，罗建勋，殷宏，等.边缘无浆体病诊断方法的研究进展[J].中国兽医科学，2008，38(07):633-638)。除常规PCR检测方法外，还有复合实时荧光定量PCR(JWCourtney, LM Kostelnik, NS Zeidner, et al.Multiplex Real-Time PCR for Detectionof Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi[J].Journal of ClinicalMicrobiology, 2004，42(7):3164-3168)、实时反转录 PCR(KR Sirigireddy, RR Gant.Multiplex Detection of Ehrlichia and Anaplasma Species Pathogens in PeripheralBlood by Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction[J].Journalof Molecular Diagnostics, 2005，7 (2): 308-316)、双重 RT-PCR(N Decaro, G Carelli, E.Lorusso,et al.Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneousdetection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale[J].Journa of Veterinary Diagnos tic Investigation, 2008, 20(5):606-611)等方法检测无浆体，虽然PCR方法的敏感性高，特异性强，但是其操作繁琐，不适合实践应用，而更适合用于长期带虫动物的检测。环介导的等温扩增技术(loopmediated isothermal amplification, LAMP)是日本学者Notomi等在2000年建立的一种快速、简单、灵敏、特异低成本的全新的核酸扩增技术(Tsugunori Notomi, Hiroto Okayama, Hatumi Masubuchi, et al.Loop-med本文档来自技高网...

【技术保护点】
采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于：该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP 反应体系建立以及采用LAMP 检测方法，所述的LAMP 检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP， F3：GCAAGCCTGATCCAGCTATG；B3：AAGCCCTGGCATTTCACC；FIP：TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG；BIP：CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。

【技术特征摘要】
1.采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:该检测方法包括LAMP引物设计、LAMP反应体系建立以及采用LAMP检测方法，所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和突光可视化检测，所述的LAMP引物设计利用Primer Explorer V4软件针对嗜吞噬细胞无浆体16S rRNA基因的6个位点设计4条LAMP引物，引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP,F3:GCAAGCCTGATCCAGCTATG ；B3:AAGCCCTGGCATTTCACC ；FIP:TGCCGGGACTTCTTCTGTAGGTTGAGTGAGGAAGGCCTTAGG ；BIP:CCAGCAGCCGCGGTAATACGCCTACATGCCCTTTACGCC。2.根据权利要求1所述的采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法，其特征在于:所述的LAMP反应体系包括: O引物混合液:外引物为F3和B3各0.2μπιο1/1，内引物为FIP和BIP各1.6Mmol/L,外内引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁长申，王金鸿，菅复春，吕亚莉，张龙现，王荣军，张艳，韩琼琼，张文静，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41