本发明专利技术涉及一种大豆胚尖生长点转化方法。包括如下步骤：获得大豆带一片子叶并暴露生长点的外植体，利用农杆菌真空渗透辅助侵染，转化得到转基因大豆。大豆的外植体为无菌环境下，无菌水培养萌发后去掉种皮，一片子叶和全部原叶，暴露生长点的胚尖；所述方法为用蘸取农杆菌的针尖对胚尖进行划刺，之后放入农杆菌液中，真空渗透辅助侵染，0.05MPa压力5-8分钟，吸取表面菌液，干燥后于无菌水中黑暗条件下共培养3天后，于光照条件下共培养7天，转入温室中直至接种，T1代检测。本发明专利技术未经组织培养阶段，不需要严格无菌，可在较短时间内获得大量再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用针头创伤大豆胚尖顶端的农杆菌介导的抽真空辅助转化大豆的遗传转化方法，属于大豆转基因研究领域。
技术介绍
卞旦\Glycine max (L.)Merr.」原产我国，世界最大的油料作物，因为大豆不仅可粮用、油用和饲用，还是植物蛋白的主要来源，又是食品、饲料等多种加工工业的优质原料。然而在普通栽培过程中，其产量和品质易受各种病虫害的影响。一直以来人们尝试用基因工程手段改良大豆种质，使其抗逆性增强。现如今抗草甘膦转基因大豆已经成为美国、阿根廷内种植面积较大的国家，全世界有200多个公司在触手适应不同气候和地区、不同生育期的抗草甘膦大豆品种。然而，在我国暂时还未得到推广，就我国国情而言，培育出具有自主知识产权的转基因大豆迫在眉睫。然而，大豆遗传转化一直受到诸多因素的限制，自1984年大豆遗传转化的首次报道。近30年的研究，大豆遗传转化效率依旧没有显著提高。其限制原因主要集中在两方面，一是大豆组织培养再生体系，现如今大豆再生体系分为器官发生途径和体细胞胚发生途径，二者普遍存在着再生率低、重复性差、基因型差异较大等问题，从而影响了后期遗传转化方面的工作；二，大豆遗传转化方面，遗传转化依赖良好的再生体系，同时大豆本身是一年生有性生殖植物，外源基因的嵌合体、稳定遗传等问题严重影响了转基因大豆的遗传效率。目前，我国大豆转化常用的外植体如子叶节、胚尖、下胚轴等，转化方法为基因枪轰击转化法和农杆菌介导转化法，然而二者均存在转化周期长、转化率第低、嵌合体严重等问题。本研究取材方便、快捷，无需组织培养阶段，无需严格灭菌，再生能力强、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统，对大豆遗传转化研究有重要意义。`
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，即利用针头创伤大豆胚尖生长点，农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖改良转化方法。其特征是利用萌发广3天的大豆种子，去掉种皮、一片子叶及真叶，暴露生长点后，用蘸有农杆菌菌液的针头轻轻的于生长点处刺划几下，利用农杆菌真空渗透法辅助侵染大豆胚尖，吸去表面菌液后，共培养至长出0.5mm芽时，接转到营养土中培养，获得92%的再生率，Fl代检测转化率为6%。本专利技术主要技术方案如下: 1、农杆菌菌液制备 在超净工作台中，用无菌移液器从LB培养平板上挑取携带有目的基因质粒的农杆菌单菌落接种于含有抗生素的LB或YEP液体培养基中，28°C，200 r/min振荡培养14-16小时，然后以1:50进行2次活化，培养至0D600 =0.5、.7左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25°C离心IOmin收集菌体，重悬液重悬菌体，按1: l(Tl: 20的比例浓缩菌体，制备好的工程菌液备用。重悬液:1/2MS+60 g/L 蔗糖+100 μ mol/L AS (乙酰丁香酮)，ρΗ5.5。2、大豆外植体的获得 挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠:浓盐酸=10:1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，通风橱中使氯气散尽，于超净工作台中，在加有SmL无菌水的带有2张滤纸的9cm平皿中放入15粒大豆种子。25-28°C黑暗环境中萌发2~3d。取胚根萌发至0.5^2cm的大豆种子，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干，用沾有农杆菌菌液的针头顶端轻轻划刺2~3下，然后将预处理好大豆胚尖放入制备好的农杆菌菌液中。3、真空渗透辅助侵染与共培养 将预处理好的大豆胚尖放入预先制备好的工程菌液中，使菌液与大豆胚尖充分接触，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟；将大豆胚尖取出，吸取表面菌液，放入灭好菌的带有2层滤纸的平皿中，每皿放置8粒，加入23mL无菌水，25-28°C黑暗环境中暗培养；3天后，向平皿中加入5~10mL无菌水，25-28°C光照环境下培养，直至胚尖顶端伸长至0.5~lcm，此时真叶也开始出现。 按营养土:蛭石:珍珠岩=6:4:1比例混合土壤，将土装入直径5cm的黑色塑料软质小花盆中，将幼苗种入花盆中，注意不能折断大豆根部,充足浇水,光照培养至4-6片叶片长出后，移栽至大田或大型花盆中，直至开花、接种后，收集种子。4、筛选，PCR检测 将TO代种子种入土壤，当小苗长出4-7片新叶时，用筛选剂喷洒植株，筛选出具有抗性的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测。本专利技术的优点和效果如下: 本专利技术提供了利用带一片子叶的暴露生长点的大豆胚尖为受体建立大豆遗传转化体系的方法，未经组织培养阶段，不需要严格无菌，可在较短时间内获得大量再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。该方法取材方便、快捷，再生能力强、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统。【附图说明】图1为预培养。图2针尖刺刷。图3农杆菌侵染抽真空。图4为成活植株。图5为草甘膦喷洒后植株。图6为pS0Y12质粒图谱。[0021 ]图7为转^75/5基因植株mSY基因PCR检测电泳图。【具体实施方式】下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。实施例1、应用材料 植物材料:合丰35大豆种子(市场购买)；菌株和质粒:农杆菌菌株为EHAlOl (市场购买，并保存与实验室)。载体为PS0Y12 (市场购买，CN201110303049.0，本实验室保存)，筛选标记基因为EPSPS基因。2、大豆外植体的获得 挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠:浓盐酸=10:1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，通风橱中使氯气散尽，于超净工作台中，在加有SmL无菌水的带有2张滤纸的9cm平皿中放入15粒大豆种子。25-28°C黑暗环境中萌发2~3d。取胚根萌发至0.5^2cm的大豆种子，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干，用沾有农杆菌菌液的针头顶端轻轻划刺2~3下，然后将预处理好大豆胚尖放入制备好的农杆菌菌液中。3、农杆菌菌液制备 在超净工作台中，用无菌移液器从LB培养平板(含卡那霉素50 mg/L，壮观霉素100mg/L，氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒pS0Y12的农杆菌EHAlOl单菌落接种于LB液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L，壮观霉素100mg/L，氯霉素25 mg/L)，28°C, 200 r/min振荡培养过夜(14-16小时)，然后以1:50进行2次活化，培养至0D600 =0.5^0.7左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25°C离心IOmin收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，按1:10的比例浓缩菌体，制备好工程菌液备用。LB培养基:10 g/L胰蛋白胨+ 5 g/L酵母提取物+ 10g/L NaCl, pH7.0，固体LB培养基另加15 g/L； 重悬液:1/2 MS+60 g/ /L 鹿糖+100 μ mol/L AS (乙酰丁香酮)，pH5.5。4、真空渗透辅助侵染与共培养 将预处理好的大豆胚尖放入预先制备好的工程菌液中，使菌液与大豆胚尖充分接触，抽真空并维持0.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
大豆改良胚尖真空渗透辅助的外源基因转化方法，步骤包括：（1）大豆外植体的获得；（2）农杆菌菌液制备；（3）真空渗透辅助侵染与共培养；（4）转化外植体再生；（5）移栽、筛选；（6）大豆外植体的获得；其特征在于：步骤（1）中，口杯氯气灭菌法：用氯酸钠：浓盐酸=10：1，在乐扣杯中制造氯气，灭菌4‑6h；超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25‑28℃黑暗环境中浸泡萌发12‑15 h ；步骤（1）中，取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶，获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 h；步骤（1）中，在超净工作台中，用无菌移液器从含卡那霉素50 mg/L 利福平霉素25 mg/L的 LB培养平板上吸取含有目的质粒的农杆菌单菌落接种于含抗生素的LB 液体培养基， 28℃， 200 r/min振荡培养14‑16小时，然后以1：10‑20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 作为工程菌液备用；步骤（3）中，将预培养 24 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5‑8分钟，28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中， 26‑28℃黑暗环境下共培养3 d。...
【技术特征摘要】
1.大豆改良胚尖真空渗透辅助的外源基因转化方法，步骤包括: (1)大豆外植体的获得； (2)农杆菌菌液制备； (3)真空渗透辅助侵染与共培养； (4)转化外植体再生； (5)移栽、筛选； (6)大豆外植体的获得；其特征在于: 步骤(1)中，口杯氯气灭菌法:用氯酸钠:浓盐酸=10:1，在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h ;超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25-28°C黑暗环境中浸泡萌发12-15h ； 步骤(1)中，取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶，获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 h ； 步骤(1)中，在超净工作台中，用无菌移液器从含卡那霉素50 mg/L利福平霉素25 mg/L的LB培养平板上吸取含有目的质粒的农杆菌单菌落接种于含抗生素的LB液体培养基，28°C, 200 r/min振荡培养14-16小时，然后以1:10-20进行2次活化，培养至0D600 =1.0，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25°C离IOmin收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0.5作为工程菌液备用； 步骤(3)中，将预培养24 h已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，28°C黑暗 环境150 r/min振荡侵染I h，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中，26-28°C黑暗环境下共培养3 do2.16 h /8 h( L/D)的光照条件下培养I...
【专利技术属性】
技术研发人员：王罡，季静，钟影，张旭强，曹越平，邱丽娟，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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