本发明专利技术提供一种蝴蝶兰PhEFP1基因、该基因编码的蛋白质和引导该基因进行表达的启动子。本发明专利技术的蝴蝶兰PhEFP1基因具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；所编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列；引导该基因表达的启动子具有SEQ?ID?NO:3所示的核苷酸序列。本发明专利技术也提供了一种用于检测蝴蝶兰PhEFP1基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量方法，和用于该方法的DNA引物。启动子序列分析表明，蝴蝶兰PhEFP1基因的启动子序列存在多种启动子元件，包含花分生组织特异基因LEAFY和AGAMOUS响应元件、与花发育相关的MADS类AGL15响应元件，及与光调控、激素信号、抗病、抗逆境和生理节律等相关响应元件。启动子功能活性分析表明，该基因的启动子具有驱动GUS基因在烟草中表达的能力。
【技术实现步骤摘要】
蝴蝶兰PhEFPI基因、其编码的蛋白及其启动子
本专利技术属于分子生物学中的基因领域，具体涉及在蝴蝶兰中与开花时间相关的PhEFPl (early flowering proteinl)基因及其启动子、含有该基因或该基因的启动子的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体，以及PhEFPl基因在促进植物开花上的应用，还有应用Real-time PCR检测PhEFPl基因在蝴蝶兰植株不同部位中表达量的方法。
技术介绍
蝴蝶兰属兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物,其花色艳丽,色泽丰富，具极高观赏和经济价值。由于大部分蝴蝶兰品种的营养生长阶段比较长，为提高商品价值，须调节蝴蝶兰的花期，使其达到全年开花，特别是应中国传统节日春节开花。目前，生产上多采用低温处理来调节蝴蝶兰的花期，以应对消费者在不同时间的需求(Chen etal.，2008)。因此，研究低温诱导蝴蝶兰花芽分化和发育相关的分子机理一直是蝴蝶兰研究的热点领域之一，如将蝴蝶兰不同品种(P.aphrodite subsp.formosana, P.equestris和P.bellina)的不同组织，如花序、花芽、根、嫩叶、老叶、冷胁迫叶、病菌浸染叶、原球茎、低温诱导的花梗芽和盛开5天的花，混合后进行转录组测序，共获得8，233个contigs和34，630个 singletons(Hsiao et al., 2011 )。此外，将低温诱导的 P.aphrodite subsp.formosana花芽进行了小RNA的测序，共获得11129条miRNA序列(An et al.，2011)。尽管这些转录组和smRNA数据在基因组学和生物技术方面提供了有益的信息，但是这些基因和smRNAs的全长和功能尚未阐明。为分离和鉴定低温诱导蝴蝶兰生殖转变的相关基因，本实验室以低温诱导的蝴蝶兰的花梗芽和处于营养生长阶段的顶叶为检测方和驱动方，利用抑制消减杂交法构建了正向cDNA文库。通过EST测序、生`物信息学分析及Real-time PCR检测，获得了一批开花调控相关的基因片段，包括蝴蝶兰early flowering proteinl基因(PhEFPl)片段FS33(GenBank登录号JK720330)。在芦笑中，其early flowering proteinl基因在营养生长期向生殖生长转变的早期，有很高水平的表达，而且开花速率与early flowering proteinl的蛋白量呈相关性(Yeo et al.，1996)。然而，蝴蝶兰PhEFPl的全长cDNA序列和启动子序列没有被公开，也没有任何蝴蝶兰PhEFPl的启动子被鉴定。为进一步了解蝴蝶兰PhEFPl基因的表达调控规律，我们克隆了蝴蝶兰PhEFPl基因的全长cDNA序列和上游的启动子序列，并分析了 PhEFPl基因的组织表达模式、鉴定了PhEFPl基因的功能和启动子活性，为阐明蝴蝶兰PhEFPl的表达调控机理和在其它植物中的应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供了一种在蝴蝶兰中表达的、与蝴蝶兰花梗芽分化与发育密切相关的PhEFPl基因的cDNA全长序列，及其编码的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供了应用Real-time PCR检测PhEFPl基因在蝴蝶兰植株不同组织和器官中的表达量的方法。本专利技术的第三个目的是提供了一种新克隆的来源于蝴蝶兰的PhEFPl基因的启动子，用于驱动外源基因在转基因植物中表达。本专利技术的第四个目的是提供了一种含有上述启动子序列的植物基因表达载体、含有上述启动子序列的植物表达载体的转基因细胞系、组织和植物个体。本专利技术的另一个目的是提供了 PhEFPl基因在缩短植物开花时间中的应用。 本专利技术是通过授权专利“蝴蝶兰FT基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列”(专利号201110158978.7)中所述的抑制消减杂交文库，从该文库中筛选到克隆子FS33(GenBank登录号JK720330,含5，非编码区，5’ UTR),根据FS33序列设计基因特异引物，利用RACE技术克隆到蝴蝶兰杂交种Phalaenopsis hybrid Fortune saltzman的earlyflowering proteinl基因的全长cDNA序列。该cDNA序列全长720bp,其序列如序列表中SEQ ID NO:1所述，将该基因命名为PhEFPl。PhEFPl的开放阅读框为从5’端第36位至第512位碱基，共477bp，其编码蛋白的氨基酸序列具有158个氨基酸残基，将该蛋白命名为PhEFPl，其序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。将PhEFPl蛋白在NCBI数据库进行Blastp搜索，结果显示，PhEFPl蛋白具有SRPBCC (START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_vl/CoxG/CalC) superfamily 保守结构域、Bet v1-1ike (Pathogenesis-related protein Bet v I family,主要花粉过敏原)保守结构域、多个氨基乙酸富含环和配基结合位点。PhEFPl蛋白分别与油棕的early floweringproteinl (ACF06553.1)有 58% 的同源性、与风信子的 pathogenesis-related protein(AAS20971.1)有 54% 的同源性，与芦笋的 early flowering proteinl (AAB09084.1)有 53%的同源性。本专利技术所述的检测PhEFPl基因在蝴蝶兰植株不同组织和器官中的表达量的方法，包括如下步骤:(I)分别提取各样品的总RNA，再将不同样品的RNA分别反转录为cDNA第一链；(2)根据核苷酸序列SEQ ID NO: 1，设计如下引物作为Real-time PCR的引物来扩增目的片段长为186bp的特异区段:PhEFPl-F:5’ -TCCTCCCCGACATCATCACC-3’〈SEQ ID N0:5>,PhEFPl-R:5’ -ACTTCTTCCCCAAATCTCCA-3’〈SEQ ID N0:6>,以蝴蝶兰的actin (AY134752.1)作为内参基因，设计特异引物:actin-F:5’ -CAGTGTTTGGATTGGAGGTT-3’ 〈SEQ ID N0:7>,actin-R:5’ -TCTCGGGTTCCATTTCCATC-3’ 〈SEQ ID N0:8>,扩增长为139bp目的片段；(3) Real-time PCR反应体系的组成、PCR扩增、数据分析及作图。根据Real-time PCR试验结果，获得PhEFPl基因在蝴蝶兰不同组织和器官中的表达量。在本专利技术的实施例中，是通过分别提取了蝴蝶兰40mm大小的花梗芽、5个不同发育阶段的花蕾、开花2d内的花、及花器官如子房、萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱、营养阶段的顶叶、成熟叶及根的总RNA，再将不同样品的RNA (1.0 u g)分别反转录为cDNA第一链；根据前述的核苷酸序列SEQ ID NO:1，设计Real-time PCR引物来扩增其特异区段，PhEFPl-F:5’-TCCTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蝴蝶兰PhEFP1基因，它具有如SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种蝴蝶兰PhEFPl基因，它具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。2.一种如权利要求1所述的蝴蝶兰PhEFPl基因编码的多肽，其特征在于，具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。3.一种用于引导如权利要求1所述的蝴蝶兰PhEFPl基因进行表达的启动子，它具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。4.一种含有权利要求1所述的PhEFPl基因编码区序列的重组植物表达载体。5.一种含有权利要求1所述的PhEFPl基因编码区序列的植物转基因细胞、组织或个体。6.一种含有权利要求3所述的启动子序列的重组植物表达载体。7.一种含有权利要求3所述的启动子序列的植物转基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：李冬梅，吕复兵，朱根发，孙映波，
申请(专利权)人：广东省农业科学院环境园艺研究所，
类型：发明
国别省市：
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