本发明专利技术涉及通过对屋尘螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要过敏原Derp2基因进行密码子优化得到优化后的基因mderp2，并以此为基础构建锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组表达质粒pNZ8148-AD和重组乳酸乳球菌L.lactis?AD（保藏号为CGMCC?No.8221）。Western?blot结果表明本发明专利技术的重组乳酸乳球菌L.lactis?AD可在菌体表面表达过敏原Derp2；同时，动物实验结果显示口服重组乳酸乳球菌L.lactis?AD可增加脾脏内调节性T细胞的水平，降低小鼠体内由屋尘螨过敏原Derp2引发的过敏反应，具有较好的预防作用。
【技术实现步骤摘要】
一种锚定表达屋尘螨过敏原DerP2的重组乳酸乳球菌及其应用
本专利技术涉及遗传资源工程，具体涉及一种锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD及其应用。
技术介绍
过敏性疾病是临床上的常见病、多发病，是当前世界性的重大卫生学问题。其中，在引发过敏性疾病的众多吸入性过敏原中，屋尘螨是导致呼吸道变态反应性疾病的重要因素之一。屋尘螨是一类结构和成分复杂的生物，目前人们已从屋尘螨的数百种蛋白中初步鉴定出几十种过敏原；过敏原Derp2是其中最为主要的过敏原之一，约80%_90%的屋尘螨过敏患者对Derp2产生过敏反应。特异性免疫治疗(SIT)被认为是最有效的治疗过敏的方法，但成功的免疫治疗取决于高质量的变应原。目前，临床上用于诊断和治疗的屋尘螨粗提液含有大量非特异性杂质，严重阻碍了屋尘螨过敏原试剂的临床应用。为获得高质量的变应原，从天然产物中分离纯化过敏原(专利申请号:200410022961.9)，操作繁复且纯度不高，重复性较差；利用分子生物学技术，在大肠杆菌(专利申请号:201210139240.0)、酵母等表达系统中表达过敏原Derp2被认为是一种可行的策略，但其安全性及后续过敏原的纯化限制了这些表达系统的实际应用。 近几年，随着对乳酸菌性质的不断研究，其益生特性逐渐被人们所认识并接受，特别是在治疗一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如过敏，肠炎等，具有普通药物所不具备的优势。以乳酸菌作为表达系统，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面进行表达释放，可以有效的避免传统表达系统(大肠杆菌)所带来的安全隐患及后续抗原的纯化问题，同时避免了在口服过程中蛋白的降解和口服耐受，更能促进抗原或功能性蛋白被免疫系统所吸收等。外源蛋白在乳酸菌中的表达方式有三种:一是目的蛋白在细胞质中表达；二是在信号肽作用下将目的蛋白分泌到培养基中；三是目的蛋白锚定在细胞壁上。将外源蛋白展示在乳酸菌表面是一种有效的研究工具并在活载体疫苗开发、诊断学、全细胞吸附剂以及新的生物催化剂等方面具有潜在应用价值。本专利技术通过对过敏原Derp2的天然基因进行密码子优化，构建锚定表达屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD ;并验证其在预防屋尘螨过敏疾病方面的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因优化的屋尘螨过敏原基因mderp2，提供一种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD (保藏号为CGMCCN0.8221)，提供将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途，提供将所述重组乳酸乳球菌L.lactis AD用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。一方面，本专利技术提供了一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2 的序列为 SEQ ID N0.1。所述基因优化的屋尘螨过敏原基因mderp2是通过对来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原 Derp2 的天然基因序列 SEQ ID N0.2 进行基因优化后获得的。另一方面，本专利技术提供了一种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌L.lactis AD(保藏号为CGMCC N0.8221 )，所述菌株是通过将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒PNZ8148上，构建锚定表达型质粒pNZ8148-AD，再将获得的锚定表达型质粒电转入宿主菌株L.lactis NZ9000而获得的。另一方面，本专利技术提供了将所述过敏原用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。再一方面，本专利技术提供了将上述乳酸乳球菌用于预防屋尘螨过敏疾病的用途。本专利技术涉及的乳酸乳球菌Lactococcus lactis AD于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址(100101)北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.8221。【附图说明】图1表示屋尘螨过敏原Derp2基因突变位点对照图。图2表不重组乳酸乳球菌L.lactis AD中Derp2蛋白的western blot检测。如图:最左侧为蛋白分子Marker ；1号泳道:纯化的Derp2,阳性对照；2号泳道:重组菌株L.lactis AD原生质体的细胞破碎液；3、4号泳道:阴性对照菌株L.1actis8148(不含Derp2基因)的上清液和细胞破碎液图3表示小鼠免疫的过程。首先进行小鼠屋尘螨过敏模型的构建，具体的构建过程分为三个阶段:首先在0-4天及7-11天进行灌胃预防处理(200 μ I菌体或生理盐水)；在第17、24、31天进行腹腔注射Der p2/Alum (Pierce，美国)(200 μ I)的混合物，使小鼠产生过敏反应；最后一个阶段为雾化阶段，通过雾化激发器将Derp2蛋白进行雾化，使小鼠通过自然呼吸的方式吸入体内。图4表示口服重组乳酸乳球菌L.lactis AD对小鼠体内过敏原特异性抗体的影响。Positive:阳性对照组小鼠！Negative:阴性对照组小鼠；8148:灌胃对照菌株L.1actis8148 (不含Derp2基因)的小鼠；AD:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠;ND:灌胃重组菌株L.1actis ND(先前构建，用作对照菌株)的小鼠图5-1表示肺部的组织形态观察(HE染色)；图5-2表示肺部的组织形态观察(甲苯胺蓝染色)；A:阳性对照组小鼠；B:阴性对照组小鼠；C:灌胃L.1actis8148 (空质粒)的小鼠；D:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠；图6表示不同组别脾脏内调节性T细胞的水平A:阳性对照组小鼠；B:灌胃重组菌株Llactis ND的小鼠；C:灌胃重组菌株L.lactis AD的小鼠；D:阴性对照小鼠本专利技术具有以下优点:目前， 临床使用的屋尘螨变应原制剂多为通过对人工饲养的屋尘螨进行灭活处理后分离纯化得到的混合物，其成分复杂，用于SIT治疗存在着无法避免的副作用。本专利技术所用的乳酸菌疫苗因为乳酸菌的可食用性，不用经过灭活及纯化处理即可用于临床使用。此外，乳酸菌作为一种常见的微生物，培养及后续操作过程简单，成本较低，可以通过制成粉状制剂、胶囊等形式的药品，携带方便，无需特殊条件即可自行服用。相比传统的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易为病人所接受，同时通过口服方式更容易使机体产生免疫耐受，缩短治疗时间。实施例下面将结合具体实施例对本专利技术做更详细的说明。1、根据乳酸乳球菌基因组数据，分析乳酸乳球菌的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列该修饰性过敏原的基因序列为SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)进行密码子优化，得到可以在乳酸乳球菌内高效表达的基因mderp2，该基因的序列为SEQ IDN0.1 ； 2、将优化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表达质粒pNZ8148(中国科学院钟瑾研究员惠赠)上，构建锚定表达型质粒PNZ8148-AD，并将质粒电转入宿主菌株L.1actisNZ9000 (中国科学院钟瑾研究员惠赠)中，得到重组菌株L.lactis AD 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2的序列为SEQ?ID?No.1。
【技术特征摘要】
1.一种基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，该过敏原基因mderp2的序列为SEQ ID N0.1。2.如权利要求1所述的基因优化的屋尘螨过敏原Derp2，其特征在于所述过敏原基因mderp2是通过对来源于屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要过敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2进行基因优化后获得的。3.—种锚定表达基因优化的屋尘螨过敏原Derp2的重组乳酸乳球菌Lactococcuslactis AD，于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，张秋香，艾春青，王刚，田丰伟，刘小鸣，赵国忠，赵建新，张灏，郭敏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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