基因工程改造的代谢木糖的微生物制造技术

本发明专利技术提供了使用木糖作为固定碳源来培养产油微生物的方法。还提供了经过了基因工程改造以便代谢作为固定碳源的木糖以允许其将木糖转化成油的微生物。本发明专利技术所提供的方法的特定优点包括通过利用木糖的微生物发酵方法来生产油而不是生产醇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因工程改造的代谢木糖的微生物 相关申请的交叉引用 根据美国法典35篇119条(e)款，本申请要求享有2011年5月6日提交的美国临时专利申请号61/483，550和2011年6月15日提交的美国临时专利申请号61/497，501的权益。这些申请中的每一个都以引用的方式整体并入本文。 序列表引用 本申请包括如详述结尾处所示的序列表。 政府利益 本专利技术在加利福尼亚州政府的支持下在加利福尼亚州能源委员会授权号PIR-08-018下完成。所述能源委员会享有本专利技术的某些权力。专利
本专利技术涉及产油微生物中木糖代谢途径的表达以允许它们代谢木糖以便生产脂类或其它有用的生物质，并且涉及由所述生物质生产的油类化学品、食品、燃料以及其它产品。 专利技术背景 在生物技术中一个重要且困难的挑战在于释放纤维素材料中碳捕获的巨大潜能用于转化成有价值的物质如液体燃料、化学品、食品和其它产品。一个特定的挑战涉及使用通常发现于解聚的的半纤维素中的木糖作为微生物异养培养的碳源。尽管在使用酵母来将木糖用于生产乙醇方面已做了很多工作，但是大多数酵母菌株不能利用木糖抑或仅能非常低效地利用木糖(参见 Jeffries, 2006，Curr.0p.Biotech.17:320-326 ;和 Wang等，2004, Biotechnol.Lett.26(11):885-890)。 某些产油微生物(例如，产油酵母和产油微藻)能够使固定碳能源转化成更高价值的产品，如甘油三酯、脂肪酸、碳水化合物以及蛋白质。此外，微藻自身可以作为食品来源体现价值。例如，已对产油微藻的某些物种进行了基因工程改造以生产“调制油”，这意味着其甘油三酯含量显示出脂肪酸链长度和饱和度的分布相对于它们所来源的品种发生了改变。参见 PCT 公布号 2008/151149、2009/126843、2010/045358、2010/063031 和 2010/063032 以及PCT 申请号 USl 1/038，463 和 USl 1/038，464。 使用产油微生物将木糖转化成有意义量的脂类和其它产品的能力将具有重要的环境意义，因为它可降低我们对化石燃料的依赖并降低微生物油的成本。 专利技术概述 一方面，本专利技术提供了一种植物界的微生物，所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。在一些情况下，所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或产生脂类。在一些情况下，所述微生物将木糖转化成甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%、或50%来源于木糖的碳原子的脂类。在一些情况下，所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的木糖。 在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种:活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。在一些情况下，所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以转运木酮糖-5-磷酸到质体中。在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。 在一些情况下，所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdom Viridiplantae)。在一些情况下，所述微生物属于绿藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylum Tetraphytina)、四胞藻纲(classTrebouxiophyceae)或者小球藻目(order Chlorellale)。在一些情况下,所述微生物属于小球藻属(genus Chlorella)或原藻属(genus Prototheca)。在一些情况下,所述微生物属于桑椹形原藻或原壳小球藻种。 在一些情况下，所述微生物进一步包含可操作以改变由微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。在一些情况下，所述重组修饰包含编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。 另一方面，本专利技术提供了一种用于生产微生物生物质或者生产由生物质产生的产品的方法，其中所述方法包括如上文或本文所讨论的，在包含木糖的培养基中异养地培养重组微生物以便将木糖转化成微生物生物质。在一些情况下，所述微生物生物质包含微生物脂类。在一些情况下，所述脂类用于制造选`自由以下组成的组的产品:化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。在一些情况下，所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。 在一些情况下，所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。在一些情况下，所述碳源的多于 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 为木糖。 另一方面，本专利技术提供了一种由如上文或本文所讨论的任何微生物生产或者通过上文或本文所讨论的任何方法生产的天然油。 另一方面，本专利技术提供了由上文所讨论的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。 另一方面，本专利技术提供了利用木糖作为碳源的重组产油微生物。在一个实施方案中，所述产油微生物是微藻、产油酵母、产油真菌或产油细菌。在另一个实施方案中，所述重组微生物是微藻细胞，包括但不限于原藻属细胞，其包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。在一些实施方案中，所述细胞是桑椹形原藻、克鲁格尼原藻(Prototheca krugani)、大型原藻(Prototheca stagnora)或小型原藻(Protothecazopfii)种的品种，并且在其它实施方案中，所述细胞具有与SEQ ID No:l至9中的一个或多个具有至少70%、75%、80%、85%或95%核苷酸同一性的23S rRNA序列。所述外源基因包含可操作地连接有启动子的编码序列，并且在一些实施方案中，所述启动子是来自原藻属物种的内源性基因。在另外的实施方案中，所述编码序列编码选自由以下组成的组的蛋白质:氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白、木糖易位体蛋白和木糖转运体蛋白。 在各种实施方案中，所述微藻细胞包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。例如，本专利技术的微藻细胞包括已经过工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物界(kingdom?Plantae)的微生物，所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.06 US 61/483,550;2011.06.15 US 61/497,5011.一种植物界(kingdom Plantae)的微生物,所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。2.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或者产生脂类。3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物将木糖转化成甘油三酯。4.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物，其中所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物，其中所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘 油三酯。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中当所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养时，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%来源于木糖的碳原子的脂类。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的所述木糖。9.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种:活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的活性木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以将木酮糖-5-磷酸转运到质体中。11.根据权利要求1至10中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。12.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdom Viridiplantae)。13.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylum Tetraphytina)、四胞藻纲(class Trebouxiophyceae)或者小球藻目(orderChlorellale)。14.如以上权利要求中任一项所述的微生物,其中所述微生物属于小球藻属(genusChlorella)或原藻属(genus Prototheca)。15.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于桑椹形原藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoide)种。16.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其进一步包含可操作以改变由所述微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。17.如权利要求16所述的微生物，其中所述重组修饰包括编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。18.一种用于生产微生物生物质或者生产由所述生物质生产的产品的方法，所述方法包括在包含木糖的培养基中异养地培养如权利要求1至17中任一项所述的重组微生物以便使木糖转化成所述微生物生物质。19.如权利要求18所述的方法，其中所述微生物生物质包括微生物脂类。20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述脂类用于制备选自由以下组成的组的产品:化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。21.如权利要求20所述的方法，其中所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。22.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述培养基包含多于50%木糖的碳源。23.如权利要求22所述的方法，其中所述碳源的高于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。24.—种利用权利要求1至17所述的微生物或权利要求18至23所述的方法中的任一项生产的天然油。25.一种由权利要求24所述的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。26.—种重组产油微生物，其包含可操作以编码木糖易位体蛋白的外源基因。27.如权利要求26所述的微生物，其选自由以下组成的组:微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。28.如权利要求27所述的微生物,其为微藻。29.如权利要求28所述的微藻，其为原藻属的物种。30.如权利要求29所述的微藻，其为桑椹形原藻。31.如权利要求26至30中任一项所述的微生物，其中已对所述外源基因进行了密码子优化以用于在所述重组产油微生物中表达。32.如权利要求26所述的微生物，其中所述木糖易位体的天然质体靶向序列已置换为来自微藻的质体祀向序列。33.如权利要求26至32中任一项所述的微生物，其中所述木糖易位体包含来自拟南芥属(genus Arabidopsis)的XPT蛋白质的氨基酸序列。34.一种重组产油微生物，其包含一个或多个外源基因，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码以下一种或多种:氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白或者木糖转运体蛋白。35.如权利要求34所述的微生物，其中所述微生物进一步包含至少一个另外的外源基因，其中所述另外的外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的蛋白质:蔗糖转化酶、月旨肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、酰基载体蛋白、去饱和酶、多糖降解酶以及赋予抗生素抗性的蛋白质。36.如权利要求34或35所述的微生物，其中所述微生物选自由以下组成的组:微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。37.如权利要求36所述的微生物,其为微藻。38.如权利要求37所述的微藻，其为原藻属的物种。39.如权利要求38所述的微藻，其为桑椹形原藻。40.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的氧化还原酶途径蛋白:木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶。41.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码木酮糖激酶。42.如权利要求41所述的微生物,其中所述木酮糖激酶包含来自毕赤酵母属(genusPichia)的XYL3蛋白质的氨基酸序列。43.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖醇脱氢酶。44.如权利要求43所述的微生物，其中所述木糖醇脱氢酶包含来自所述毕赤酵母属的XYL2蛋白质的氨基酸序列。45.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖还原酶。46.如权利要求45所述的微生物，其中所述木糖还原酶包含来自所述毕赤酵母属的XYLl蛋白质的氨基酸序列。47.如权利要求34至39...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·蔡，A·索曼奇，
申请(专利权)人：索拉兹米公司，
类型：
国别省市：