一种生产乙醇的光合微生物制造技术

本发明专利技术提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶基因。本发明专利技术还提供了制备所述基因工程蓝藻的载体和制备方法，以及使用所述基因工程蓝藻生产乙醇的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可再生能源和生物
具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。
技术介绍
进入21世纪以来，原油价格居高不下，太阳能、风能、潮汐能等开发利用成本居高不下，而各国对环境保护的要求在不断的提高，因此，如何开发替代能源的问题受到各国普遍关注。许多国家将加快发展可再生能源作为发展替代能源的重要战略，生物能源是其中发展最快的领域。目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。专利技术名称为“基因修饰酵母物种和使用基因修饰酵母的发酵方法”的中国专利200480019052. 8公开了用外源木糖异构酶基因转化酵母细胞。额外的基因修饰增强了所转化的细胞将木糖发酵成乙醇或者其产物的能力。那些修饰包括缺失非特异或特异的醛糖还原酶基因、缺失木糖醇脱氢酶基因和/或超表达木酮糖激酶。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。专利技术名称为“大肠杆菌乙醇发酵工程菌及其应用”的中国专利200710177003. 2公开了一种耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。经多代的定向筛选得到了高耐乙醇的大肠杆菌突变株，并在所述突变株中转入了运动发酵单胞菌的乙醇脱氢酶基因I I和丙酮酸脱羧酶基因，得到了一种新型耐乙醇的大肠杆菌乙醇发酵工程菌。该工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物发酵生产乙醇时，在高浓度乙醇下依然能够保持较高的发酵速率，而且有较高的乙醇转化率。蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻的细胞质中都有内膜系统。蓝藻的细胞质中具原始的片层结构，片层上分布有光合色素叶绿素和藻胆素(包括藻蓝素和藻红素两种)及类胡萝卜素。蓝藻的叶绿素可以进行光合作用，并且其细胞可以提供光合作用所需的能量，所以蓝藻可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等) 中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)催化，乙醒到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase2,ADHB)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因pdc，因而不具有利用阳光和二氧化碳产生乙醇的能力。本专利技术提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造， 从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。
技术实现思路
本专利技术以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本专利技术还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。本专利技术提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因在蓝藻细胞内分别编码具有丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶活性的蛋白。本专利技术使用的宿主是蓝藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属 (Aphanocaps)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属 (Scytonema)或鞭枝藻属(Mastigocladus)。本专利技术的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystis sp.)。在本专利技术的一个方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本专利技术的基因工程蓝藻含有整合到染色体上的编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的核酸。丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxyla se, PDC)广泛存在于豆类植物、麻黄等植物、酿酒酵母属(Saccharomyces species)、曲霉属等真菌中，另外运动单胞菌(Zymomonas mobilis)、醋杆菌属(Acetobacter species)中也都含有丙酮酸脱羧酶。不同来源的丙酮酸脱羧酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的丙酮酸脱羧酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。其中，如Genebank报道的，运动单胞菌的丙酮酸脱羧酶具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQ ID NO. 2的核酸序列。不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但都具有对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应CH3CH2OH+NAD+ — CH3CHO+NADH+H+。在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢。酵母和细菌(乳酸菌，以及某些条件下的大肠杆菌除外)不将葡萄糖发酵为乳酸，而是将葡萄糖发酵为乙醇和二氧化碳。总反应式为Glucose+2ADP+2Pi —2ethanol+2C02+2ATP+2H20。在酵母和许多细菌中，乙醇脱氢酶在发酵起着重要作用从糖酵解产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，随后乙醛在ADHI的作用下转化为乙醇。后一步的目的是重新产生NAD+，于是糖酵解的能量生成得以继续。不同来源的乙醇脱氢酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的乙醇脱氢酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的乙醇脱氢酶的序列和活性有所区别。其中，如Genebank报道的，聚球藻的其中一种乙醇脱氢酶ADH B具有如SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：范文俊，郑晓光，
申请(专利权)人：浙江齐成碳能科技有限公司，
类型：发明
国别省市：