一种利用光能生产乙醇的微生物制造技术

本发明专利技术提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和外源乙醇脱氢酶，所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有点突变。本发明专利技术还提供了制备所述基因工程蓝藻的载体和制备方法，以及使用所述基因工程蓝藻制备乙醇的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可再生能源和生物
具体涉及一种经过基因工程修饰后可通过光合作用高效生产乙醇的微生物，以及所述基因工程修饰微生物的方法和运用此基因工程微生物制备乙醇的方法。
技术介绍
石化能源为国民经济与社会发展的重要物质基础，但石化能源具有稀缺性和不可再生性，随着时间的推移，其价格必将因储量的减少和开采量的下降而上涨。此外，电力行业高度依赖煤炭资源，是造成威胁着电力供应的“煤炭矛盾”长期存在的根本原因之一。 因此，可再生能源具有长远的发展潜力和广阔的市场前景。可再生能源产业的发展必然对相关产业的发展起到带动作用，这将使我国的国民经济结构更加合理。目前的液体生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速发展面临着粮食安全和土地淡水资源紧缺问题。现有技术通过燃料乙醇产业作为替代能源，但是，随着燃料乙醇产量增加，粮食供给短缺和价格上涨导致以粮食为原料的生物能源产业不能持续性发展。近几年大力发展的非粮燃料乙醇和生物质发电产业同样受到客观条件的制约，难以满足大规模替代化石燃料的规模和成本要求。以木薯、甜高粱、纤维素为原料的燃料乙醇产业从本质上说是以种植业为基础的，需要大规模投入可耕地、淡水、化肥以获得较高产量，而这些资源均为稀缺资源，用于替代化石能源将对整体资源环境造成巨大压力。因此，迫切需要开发不占用可耕地、淡水、化肥资源的新型生物能源技术，为可再生能源产业发展提供具备现实可行性的手段，切实有效减少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促进基于化石能源的传统工业体系向基于可再生能源的绿色工业体系转化。对微生物进行基因工程改造来生产能源是能源产业中的一个发展方向。但现有技术中，工业上主要是利用具有乙醇代谢途径的异养微生物，例如酵母和大肠杆菌等。蓝藻是一种自养微生物，是目前地球上最广泛的生物体。蓝藻是单细胞生物，没有细胞核，但细胞中央含有核物质，通常呈颗粒状或网状，染色质和色素均匀的分布在细胞质中。蓝藻的细胞质中都有内膜系统，可以进行光合作用，产生自己所需要的物质，即可以自养。但是，自然存在的光合细菌蓝藻通常不能利用阳光和二氧化碳合成乙醇，仅在避光和无氧条件下通过发酵产生少量乙醇。本领域已知生产乙醇的微生物(例如大肠杆菌，酵母菌，运动发酵单细胞菌等)中存在乙醇生产的代谢途径。已知的乙醇生产代谢途径是从糖酵解途径的丙酮酸经过乙醛再到末端代谢产物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反应过程由丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)催化，乙醒到乙醇的反应过程由乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)催化控制。蓝藻的基因组中不存在丙酮酸脱羧酶基因，因而不具有产生乙醇的能力。本专利技术提供了一种利用基因工程蓝藻生产乙醇的方法，经过对野生蓝藻的改造， 从而使得蓝藻能够直接利用太阳光和二氧化碳生产乙醇。
技术实现思路
本专利技术以蓝藻为宿主，将外源乙醇代谢途径的丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因导入蓝藻，形成具有稳定遗传性状和较高乙醇产率的基因工程菌株，使得改造的蓝藻菌株能够利用阳光、水和二氧化碳生产乙醇。本专利技术还提供了基因工程蓝藻通过光合作用利用阳光、水和二氧化碳制备乙醇的方法。本专利技术提供了一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因。外源丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因在蓝藻细胞内编码具有丙酮酸脱羧酶活性和乙醇脱氢酶活性的蛋白。本专利技术使用的宿主是蓝藻，其可以是集胞藻(Synechocystis)、隐球藻属 (Aphanocaps)、鱼腥藻属(Anobaena)、念珠藻属(Nostoc)、颤藻属(Oscillatoria)、聚球藻属(Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻属(Agmmenellumm)、双歧藻属 (Scytonema)或鞭枝藻属(Mastigocladus)。本专利技术的蓝藻优选为集胞藻(Synechocystis sp.)。在本专利技术的一个方面，采用的宿主是集胞藻PCC6803。本专利技术的基因工程蓝藻含有整合到染色体上的编码丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的核酸。丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)广泛存在于豆类植物、麻黄等植物、酿酒酵母属(Saccharomyces species)、曲霉属等真菌中，另外运动单胞菌(Zymomonas mobilis)、醋杆菌属(Acetobacter species)中也都含有丙酮酸脱羧酶。不同来源的丙酮酸脱羧酶，其编码序 列和活性有所不同。已经对各种来源的丙酮酸脱羧酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但也具有很多保守的区域和活性位点。其中，如Genebank报道的，运动单胞菌的丙酮酸脱羧酶具有如SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其基因pdc具有如SEQ ID NO. 2的核酸序列。不同来源的丙酮酸脱羧酶的序列有所区别，但都具有对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogena se,ADH)大量存在于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中，是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异性，其分子由两个亚基组成，其中一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。乙醇脱氢酶够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应CH3CH20H+NAD+ — CH3CH0+NADH+H+。 在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢。酵母和细菌(乳酸菌，以及某些条件下的大肠杆菌除外)不将葡萄糖发酵为乳酸， 而是将葡萄糖发酵为乙醇和二氧化碳。总反应式为Glucose+2ADP+2Pi —2ethanol+2C02+2 ATP+2H20。在酵母和许多细菌中，乙醇脱氢酶在发酵起着重要作用从糖酵解产生的丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳，随后乙醛在ADHI的作用下转化为乙醇。后一步的目的是重新产生 NAD+，于是糖酵解的能量生成得以继续。不同来源的乙醇脱氢酶，其编码序列和活性有所不同。已经对各种来源的乙醇脱氢酶进行了测序和活性研究，发现不同来源的乙醇脱氢酶的序列和活性有所区别。其中，如Genebank报道的，聚球藻的其中一种乙醇脱氢酶ADH B具有如SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，其基因adhB具有如SEQ ID NO. 4的核酸序列。不同来源的乙醇脱氢酶的序列有所区别，但可具有对应于SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，其中存在保守序列和活性位点。根据生物学理论知识，生物的蛋白的氨基酸序列会发生变异，所述蛋白的变异通常是由编码该蛋白的基因的突变造成基因的突变可以是自发。现代基因工程技术令有目的的点突变变成可能。点突变法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上对某个核酸或多个核酸进行设计好的突变，例如通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，成为基因研究工作或产业开发中一种非常有用的手段。氨基酸蛋白质是生物体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用光合作用生产乙醇的基因工程蓝藻，其含有整合到染色体上的外源基因，所述外源基因为丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，其中所述丙酮酸脱羧酶基因编码的丙酮酸脱羧酶具有对应于SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的苏氨酸Thr具有突变，以及所述乙醇脱氢酶基因编码的乙醇脱氢酶具有对应于SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列，其中所述第290位的苏氨酸Thr突变为酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，优选为酪氨酸(Tyr)。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：范文俊，郑晓光，
申请(专利权)人：浙江齐成碳能科技有限公司，
类型：发明
国别省市：