一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒，包被有包被原的酶标板，酶标记物，铜离子螯合物特异性单克隆抗体或多克隆抗体，铜离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，洗液，稀释后的螯合剂EDTA。本发明专利技术的检测铜离子的酶联免疫试剂盒具有下列各项优点：①特异性强，敏感性高，最低检测限为0.42μg/L，检测范围为2.83～456.04μg／L。②简便、快速、时效性强。③结果显示形象、直观、准确。④费用低廉，适用范围广，便于推广，能够现场监控且适合大量样本筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测样品中重金属铜离子含量的酶联免疫试剂盒
：本专利技术涉及一种用于检测铜离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
技术介绍
：重金属污染主要指生物毒性显著地汞、铬、镉、铅以及类金属砷，还包括具有毒性的重金属铜、钴、镍、锡等污染物。随着城市的扩大和大规模工业的发展，大量重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危害，通过饮用水，或者通过生物富集以及食物链等方式最终威胁人体健康。重金属污染不同于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。重金属铜是自然界存在的一种重要的金属元素。由于具有多种优良性特性，铜及其化合物在工农业中应用十分广泛。常量铜对农作物或人均是营养物质，而过量时就会产生危害。随着工农业生产的快速发展，铜的用途越来越广泛，用量不断增加，含铜污染物的排放也越来越多，对土壤等环境的污染逐渐显现出来。重金属的污染来源具有多样性，农作物中积累的重金属离子通过食物链的生物放大作用进入人、畜体内，威胁着人、畜健康。重金属污染是食品、环境、卫生监测的重要内容之一，铜及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。传统的重金属监测方法原子吸收光谱分析、电感耦合等离子发射光谱分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被Cu2+-ITCBE-OVA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Cu2+-ITCBE-BSA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Cu2+mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Cu2+螯合物配置的标准品稀释液、洗液PBST为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述抗原Cu2+-ITCBE-OVA、Cu2+-ITCBE-BSA的制备步骤如下：(1)铜离子螯合物的改造与鉴定称取76.7mg纯度为99.99％的硝酸铜溶于100μL纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为409mmol/L铜溶液；称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制EDTA溶液；将两者混匀后，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+-EDTA鳌合物溶液；将100μg/mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；根据铜离子标准品稀释液绘制的标准曲线计算出所螯合物中的铜离子含量；(2)铜离子人工抗原的合成与鉴定分别称取牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA20mg溶于1mL浓度为10mmol/L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液HBS中形成BSA或OVA溶液；称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸ITCBE溶子1mL二甲基亚砜中形成23nmol/L金属鳌合剂溶液；分别取160μL浓度为23nmol/L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到1mLBSA或OVA溶液中，用10mol/LNaOH调节pH至9.0，室温下反应24h；反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mmol/L，pH9.0HBS冲洗3次，再用10mmol/L，pH7.4的HBS缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属鳌合剂；取16μL浓度为409mmol/L铜溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天；所得产物即分别为纯化的铜离子鳌合后的人工抗原：Cu2+-ITCBE-BSA，包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度；所述单克隆抗体Cu2+mAb、多克隆抗体Cu2+pAb的制备步骤如下：(1)铜离子单克隆抗体Cu2+mAb的获得用Cu2+-ITCBE-BSA分别免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为20μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射；采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Cu2+mAb；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量；(2)多克隆抗体Cu2+pAb的获得用Cu2+-ITCBE-BSA免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，加等量弗氏完全佐剂FCA乳化；加强免疫，加等量弗氏不完全佐剂FIA乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一...

【专利技术属性】
技术研发人员：范国英，王自良，王爱萍，张海棠，姜金庆，王顺岗，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：