一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法技术

本发明专利技术涉及一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，选用常规铁皮石斛组培过程中产生的特定原球茎，将其在无菌条件下转入含秋水仙素的培养基中进行四倍体诱变处理，然后转入原球茎诱导分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，并对纯合四倍体植株进行性状筛选，切取性状优良的四倍体植株的茎段转接入原球茎诱导培养基中，续代后将原球茎进行诱导分化出再生纯合四倍体无毒植株。本发明专利技术培育方法简便易行，不受季节气候影响，缩短了常规育种的时间，一次性即可获得数万株优质同源纯合四倍体石斛种苗，可大大提高铁皮石斛的产量和品质。

Method for large breeding of Autotetraploid pure tetraploid Dendrobium officinale

The invention relates to a method for breeding a large number of homologous tetraploid Dendrobium, specific protocorm of Dendrobium candidum was produced using conventional process, put it into a tetraploid processing medium containing colchicine in sterile conditions, and then transferred to the protocorm differentiation of cultured regenerated plant medium, cultivation and management according to the conventional methods, root tip chromosomes of regenerated plants were detected, tetraploid plants were screened, and the tetraploid plants were screened, stems from the excellent characters of tetraploid plants were cut to access the protocorm induction medium, continued generation after the protocorm differentiation of the regenerated tetraploid non-toxic plant. The cultivation method is simple, not affected by seasonal climate, shorten the breeding time, one can obtain high quality strains of tens of thousands of homologous tetraploid Dendrobium seedlings, can greatly improve the yield and quality of Dendrobium candidum.

【技术实现步骤摘要】
—种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法
本专利技术涉及一种铁皮石斛新品种培育方法，尤其是一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，属于生物技术育种领域。
技术介绍
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统名贵珍稀中药材,具有益胃生津、滋阴清热、增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等独特的功效。1000多年前的《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草之首”，其在民间也素有“救命仙草”之称，国际药用植物界将之誉为“药界大熊猫”。虽其功效独特但目前野生资源已濒临枯竭，加之人工种植投入高，且现有二倍体石斛种质难以保证、生长缓慢，成活率低下，造成人工种植铁皮石斛的产量低，品质参次不齐，农户种植积极性低下，国内市场供需矛盾日益突出，而现代多倍体育种技术为繁育出高产、抗逆性强，药用成份高的优质铁皮石斛提供了可能，通过多倍体育种技术可大大提升铁皮石斛的种植积极性，促进我国石斛产业的发展。经对现有技术文献检索发现铁皮石斛四倍体研究鲜有报道，仅发现专利200710061225.8报道了铁皮石斛四倍体的培育方法，虽此法诱变率较高但存在一定的缺陷:a、以石斛种子为出发点，受季节气候影响有一定的局限性。b、育种周期长，从授粉、播种、诱变、种植、培育、育种到产业化应用需五年以上的时间。C、四倍体植株中嵌合四倍体的频率较高，种质难以保证d、一次仅可获得百株四倍体植株，仅适用于实验室研究阶段，难以满足实际产业化生产需求，需进一步改进。
技术实现思路
针对传统方法的不 足，本专利技术提供了，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性和培育产量。为实现以上目的，本专利技术提供了如下技术方案:，其特征在于包括以下步骤:选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。优选，所述的四倍体诱变处理为，在含0.0r0.06wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS (MS基本培养基的中大量元素浓度减为1/3~1/2)液体培养基中诱变处理6(T72h，优选是含0.05wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基。优选，所述的原球茎分化培养基为:萘乙酸(NAA) 0.5^1.5mg/L+花宝I号0.4~1.0g/L+蔗糖2-4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固体培养基。作为改进，所述的切取具有优良性状的纯合四倍体植株茎段，其切方法为从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基，每个母瓶中接种一个茎段。优选，所述的原球茎诱导培养基的组成为1/31/2MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+ 活性炭 0.5~1.5g/L与现有技术相比，本专利技术的优点在于:采用石斛组培过程中产生的原球茎为材料进行四倍体诱变，不受季节气候的影响，对根尖染色体镜检后用流式细胞仪筛选出纯合四倍体植株，将性状优良的四倍体植株的茎段转接愈伤组织诱导培养基中，经续代、分化一次性即可获得数万株优质纯合同源四倍体铁皮石斛种苗，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性,可以大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛，提高了铁皮石斛的品质和产量。 【附图说明】图1是黄绿色原球茎照片；图2是四倍体植株照片；图3是二倍体2n=38染色体的照片；图4是四倍体染色体2n=76的照片；【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。，包括以下步骤:I)选取原球茎:选取在石斛组培续代1~4代过程中产生的原球茎，要求选取黄绿色且没有原球茎尖分化的原球茎。2)四倍体诱变处理:无菌条件下将选取的原球茎转入含有0.05%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中进行诱变处理60~72h。3)原球茎的分化诱导:将诱变处理过的原球茎用无菌水冲洗3飞次，转接于含ΝΑΑ0.5~L 5mg/L+花宝I号0.5~0.8g/L+蔗糖2~4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500LUX，光照时间12h/d，温度23~27°C的条件下培养，中间续代一次，待植株长至3飞cm移栽进行正常管理栽培。4)四倍体的鉴定与筛选:对再生植株进行编号标记后，对标记植株根尖的染色体进行镜检，染色体镜检结果为2n=76的植株是诱变成功的四倍体植株，进而用流式细胞仪从中筛选出纯合四倍体株系。5)四倍体植株原球茎的诱导:在无菌条件下切取性状优良的纯合四倍体植株的茎段，切取茎段要求从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基中(1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.5mg/L+活性炭0.5~1.5g/L。)，每个母瓶中接种一个茎段。6)原球茎的分化诱导:诱导出的原球茎基于步骤3所述的分化培养基中进行诱导分化，半年后可一次性获得数万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。实施例:选取选取在石斛组培续代第I代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，无菌条件下将选取的原球茎转入含有0.05%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中进行诱变处理60h。在超净工作台上将诱变处理过的原球茎用无菌水冲洗3次，转接于含NAA1.0mg/L+花宝I号0.6g/L+蔗糖3wt%+香蕉12wt%的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500Lux，光照时间12h/d，温度24±1°C的条件下培养，30d后续代一次，待植株长至3cm后炼苗7天，编号后移栽入种植基地进行正常管理栽培。半年后选取长势好、茎粗大的植株的根尖进行镜检，染色体镜检结果为2n=76的植株是诱变成功的四倍体植株，用流式细胞仪从四倍体植株中筛选出纯合四倍体株系。a、在无菌条件下切取编号为L-99的纯合四倍体植株的茎段(切取茎段时从相连的两个茎节节点处斜切，下同)，将切取的4段茎段接种于含6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+活性炭0.5g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500Lux，光照时间12h/d，温度24± 1°C的条件下培养35d后诱导出原球茎，将原球茎续代2次后转入原球茎分化培养基，7个月后一次性获得2.8万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。b、在无菌条件下切取编号为L-121的纯合四倍体植株的茎段，将切取的5段茎段接种于含6-BA0.4mg/L+NAA0.4m g/L+活性炭1.0g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500LUX，光照时间12h/d，温度25±1°C的条件下培养35d后诱导出原球茎，将原球茎续代3次后转入原球茎分化培养基，7个月后一次性获得9.5万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。C、在无菌条件下切取编号为L-326的纯合四倍体植株的茎段，将切取的5段茎段接种于含6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1.5g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于包括以下步骤：选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。

【技术特征摘要】
1.一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于包括以下步骤:选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。2.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于所述的四倍体诱变处理为，在含0.04、.06 (wt) %秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中诱变处理.60~72h。3.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源四倍体铁...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振达，何心展，马春光，付文飞，
申请(专利权)人：宁波洛祥药业有限公司，
类型：发明
国别省市：