本发明专利技术涉及生物检测鉴定方法，尤其涉及柑橘黄龙病病原PCR检测方法。一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括待检样品DNA提取；配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；PCR扩增反应；PCR扩增产物检测，其中所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×Taq?PCR?Master?Mix2.5μL、引物0.25μL，其余为灭菌双蒸水。本发明专利技术的第一轮和第二轮各自PCR扩增总反应体系均为7μL～10μL，可达到20或25μL反应体系检测出来的效果，大幅度降低了检测经济成本；本发明专利技术所需的试剂量少，能减轻对环境的污染。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物检测鉴定方法，尤其涉及柑橘黄龙病病原PCR检测方法。一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括待检样品DNA提取；配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；PCR扩增反应；PCR扩增产物检测，其中所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×Taq?PCR?Master?Mix2.5μL、引物0.25μL，其余为灭菌双蒸水。本专利技术的第一轮和第二轮各自PCR扩增总反应体系均为7μL～10μL，可达到20或25μL反应体系检测出来的效果，大幅度降低了检测经济成本；本专利技术所需的试剂量少，能减轻对环境的污染。【专利说明】—种柑橘黄龙病病原PCR检测方 法
本专利技术涉及生物检测鉴定方法，尤其涉及柑橘黄龙病病原PCR检测方法。
技术介绍
柑橘黄龙病是为害柑橘最严重的病害之一，被国内外列为植物重点检疫对象，病原为类细菌，可以通过嫁接传染，苗木扩散，在田间则通过柑橘木虱传播。它不仅使叶片转黄，还使柑橘产量降低、品质下降，病情严重时会使根系腐烂，甚至会造成整片橘园被毁，是柑橘管护中的重要防治对象。常规PCR检测技术只需要一对引物，准确度不够高；由于柑橘黄龙病病原PCR检测反应体系所需的各种试剂、药品价格昂贵，很多科研院所研究由于经费有限，无力承担高额检测费用，尽管很多地方的柑橘生产部门有检测疑似黄龙病样品的要求，但也由于检测经费捉襟见肘，往往也没有能够完成实际上的检测任务指标，地域来源复杂及海量样品的检测更是难以实现，这就造成一方面全国柑橘黄龙病有逐年蔓延发展趋势，一方面却由于样品的检测成本居高不下，柑橘生产实践与理论的严重脱节的现象。同时，检测所需的试剂、药品均有毒性，会造成环境污染。当前，柑橘黄龙病亚洲种病原的PCR检测技术总反应体系一般都是20 μ L或25 μ L，试剂使用量大、资源耗费高。所以急需研发出一种经济实用、环境污染小、准确度高的巢氏PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法。本专利技术的目的通过如下技术方案实现:一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括如下步骤:(I)待检样品DNA提取；(2)配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；(3) PCR 扩增反应；(4) PCR扩增产物检测，其中所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7 μ L~10 μ L，其中DNA模板 2.5 μ L、2 X Taq PCR Master Mix2.5 μ L、引物 0.25 μ L，余量为灭菌双蒸水。优选的是:所述的待检样品DNA的0D26Q/0D28Q值为1.7~1.9。优选的是:所述的第一轮PCR扩增体系中，DNA模板由待检样品DNA稀释100倍体积后制得。优选的是:所述的2 X Taq PCR Master Mix 不含染料，其中 dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度相同，为0.4mmol/L ；Mgcl2浓度为4mmol/L ；Taq酶和Pfu DNA聚合酶总浓度为0.05U/μ L0优选的是:所述的第一轮PCR扩增体系中，使用的引物为柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA引物，所述引物为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2，序列表信息如下所示:SEQ ID NO:1:5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'SEQ ID NO:2:5/ -AAGGAGGTGA TCCAGCC-3'，引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2浓度相同，为5 μ mol/L，两条引物体积比为1:1。优选的是:所述的第二轮PCR扩增体系中，使用的引物为柑橘黄龙病亚洲种的16SrDNA引物，所述引物为SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4，序列表信息如下所示:SEQ ID NO:3:5' -GCGCGTATGC AATACGAGCG GCA-3'SEQ ID NO:4:5' -GCCTCGCGAC TTCGCAACCC AT-3/ ，引物SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4浓度相同，为5 μ mol/L，两条引物体积比为1:1。优选的是:所述的第二轮PCR扩增体系中，DNA模板由第一轮PCR产物稀释20倍体积后制得。优选的是:所述的PCR扩增反应包括第一轮扩增反应和第二轮扩增反应第一轮PCR扩增反应条件为94°C预变性4min，94°C变性45sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，35个循环，72°C最后延伸7min ;第二轮PCR扩增反应条件为94°C预变性4min，94°C变性45sec, 55°C退火 30sec, 72°C延伸 45sec, 35 个循环，72°C最后延伸 7min。本专利技术的有益效果:(I)本专利技术的PCR扩增总反应体系为7yL~IOyL,在大幅度减少2XTaq PCRMaster Mix和引物剂量的基础上， 可达到20 μ L或25 μ L反应体系检测出来的效果，大幅度降低了检测经济成本。(2)本专利技术所需的试剂量少，能减轻对环境的污染。(3)巢氏PCR检测克服了常规PCR检测单次扩增“平台期效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了 PCR的敏感性；降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二轮扩增反应能否进行，也是对第一轮扩增反应正确性的鉴定，因引可以保证整个反应的准确性及可行性。【专利附图】【附图说明】图1是实施例1中20 μ L扩增体系经过PCR扩增反应后的电泳图；图2是实施例1中7 μ L扩增体系经过PCR扩增反应后的电泳图。【具体实施方式】下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此外，在阅读本专利技术的内容后，本领域的技术人员可以对本专利技术作各种修改，这些等价变化同样落于本专利技术所附权利要求书所限定的范围。柑橘黄龙病亚洲种的16S rDNA 引物 SEQ ID NO:1/SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3/SEQID NO:4由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物SEQ ID NO:1/SEQ ID N0:2序列表信息如下:SEQ ID NO:1:5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'SEQ ID NO:2:5/ -AAGGAGGTGA TCCAGCC-3'。引物SEQ ID N0:3/SEQ ID NO:4序列表信息如下:SEQ ID NO:3:5' -GCGCGTATGC AATACGAGCG GCA-3'SEQ ID NO:4:5' -GCCTCGCGAC TTCGCAACCC AT-3/。实施例1 剪取疑似有黄龙病叶片的主叶脉约lOOmg，加入液氮充分研磨至粉末状，置于-20°C冰箱保存备用。按照试剂盒提供的方法提取DNA(试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，为快捷型植物基因组DNA提取系统)。DNA提取液通过紫外分光光度计检测，DNA的0D26(i/0D28(i值为1.7，加TE Buffer稀释100倍体积后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柑橘黄龙病病原PCR检测方法，包括如下步骤：(1)待检样品DNA提取；(2)配制PCR扩增体系，所述的扩增体系包括第一轮PCR扩增体系和第二轮PCR扩增体系；(3)PCR扩增反应；(4)PCR扩增产物检测，其特征在于：所述的第一轮和第二轮PCR扩增体系最终体积为7μL～10μL，其中DNA模板2.5μL、2×Taq?PCR?Master?Mix2.5μL、引物0.25μL，余量为灭菌双蒸水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宏明，廖惠红，王茜，徐宁，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：
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