一种基于点击反应的还原糖定量检测方法技术

本发明专利技术属于分析化学领域，涉及一种基于点击反应的还原糖定量检测方法。本发明专利技术利用巯基丙酸修饰纳米金，进而通过酰胺反应分别固定炔基、叠氮基；以葡萄糖为目标检测物，利用葡萄糖的还原性将二价铜还原为一价铜，后者充当点击反应的催化剂，促使炔基与叠氮基之间发生环加成反应，从而改变纳米金间距，使纳米金聚集变色。根据纳米金的聚集程度，判断催化剂一价铜的含量，进而实现对生物样品中还原糖的定量检测。该方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，重现性，灵敏度相较于以往还原糖检测手段有明显提高，是一种在食品科学、分析化学、医学等领域中具有广阔应用前景的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于分析化学领域，涉及。本专利技术利用巯基丙酸修饰纳米金，进而通过酰胺反应分别固定炔基、叠氮基；以葡萄糖为目标检测物，利用葡萄糖的还原性将二价铜还原为一价铜，后者充当点击反应的催化剂，促使炔基与叠氮基之间发生环加成反应，从而改变纳米金间距，使纳米金聚集变色。根据纳米金的聚集程度，判断催化剂一价铜的含量，进而实现对生物样品中还原糖的定量检测。该方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，重现性，灵敏度相较于以往还原糖检测手段有明显提高，是一种在食品科学、分析化学、医学等领域中具有广阔应用前景的检测方法。【专利说明】
本专利技术属于分析化学领域，涉及。
技术介绍
近半个世纪，关于还原糖的研究和应用己有了很大的发展，在食品分析、发酵控制、临床检验等方面发挥着重要的作用。但由于糖类物质自身的结构复杂性以及研究手段的局限性，使得多年来糖类物质的研究明显落后于蛋白质和核酸的研究。葡萄糖作为一种最常见的还原糖，是生物体中许多生化反应的指标物质，具有供给能量、补充血糖、强心利尿、促进解毒功能的作用，因此，以葡萄糖为代表的还原糖的快速检测和识别对食品安全、糖生物学、医学等领域的发展具有重要意义。纳米金(AuNPs)独特的高活性、易修饰性、高比表面积以及极强的表面等离子体共振效应等特点，使其具有常规大尺寸材料所不具备的优越性能，因此在分析化学领域得到迅速发展，并受到了越来越多的重视，成为分析化学的有力工具。为实现对特定物质的选择性检测，对AuNPs的表面进行适当的修饰显得尤为重要。由于金能够和巯基形成稳定的共价键(Au-S)，因此纳米金表面很容易通过化学修饰固定上特异性的识别基团。过去几年来，以AuNPs为探针的传感器被广泛用于检测核酸、蛋白质、病毒、金属离子、等。当纳米金用于光学检测时，由于具有良好的光学和电子学特性，能够实现信号的放大，从而提高检测的灵敏度。点击反应(Click-reaction)是由Sharpless等提出的一种新型的组合化学合成方法，其中最典型的反应是通过叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应生成1，2，3-三唑，该反应条件温和、高效和高控制性、产物单一，并且具有很好的生物兼容性等特点。这些独特的性质，对活体内(in vivo)和活体外(in vitro)生物的共轭修饰起到了重要作用。同时，点击反应还被广泛应用于有机体中蛋白质和DNA的标记、功能材料的合成与修饰等。必须指出的是，这种环加成反应在一价铜催化条件下，反应速率能提高IO6倍，因此，使得我们利用点击反应构建的还原糖比色传感器能在不到IOmin完成整个检测过程。传统的还原糖检测手段主要有红外光谱法、高效液相色谱法、气质联用以及各式各样的酶传感器，这些检测手段通常伴随着繁琐的样品前处理，大型仪器以及受过培训的操作人员，费时费力；传统的比色检测方法:斐林试剂检测则需要对检测样品进行加热至沸的处理，同时检测灵敏度不高，重复性差，无法进行微量还原糖的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便快速定量检测微量还原糖的方法。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:，先用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺作用在纳米金表面分别固定上炔基和叠氮基，再加入还原糖和新配置的二价铜，通过还原糖还原二价铜到一价铜提供点击反应所需的催化剂，完成叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝；通过检测还原糖的吸光度，实现对样品中还原糖的定量检测。所述的基于点击反应的还原糖定量检测方法优选包括以下步骤:(I)用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺反应在纳米金表面分别固定炔基和叠氮官能团，得到表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液；(2)将两种功能性纳米金溶液混合，向其中加入一系列浓度的还原糖标准品，再加入新配置的氯化铜溶液，将混合溶液于70°C保温反应IOmin ；(3)将上述混合溶液通过微孔板检测系统SpectraMax M3进行光学扫描，得到不同浓度的还原糖标准品溶液对应的紫外-可见光谱；使用吸光度比值A65(i/52(i作为纵坐标，还原糖浓度为横坐标，绘制标准曲线；(4)按照上述方法测定样品的紫外-可见光谱，将其吸光度比值A65(i/52(i带入上述标准曲线，计算得到样品中还原糖的浓度。其中，步骤(I)所述的表面修饰了炔基的功能性纳米金溶液和表面修饰了叠氮基的功能性纳米金溶液的制备方法:在纳米金溶液中加入巯基丙酸，使最终溶液中纳米金溶液与巯基丙酸的浓度分别为1.0-2.3nM与0.1-0.5 μ M，静止l_24h ;在10 μ L浓度分别为4mM和ImM的1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的催化条件下，加入18 μ L20 μ M的炔丙胺或18 μ L20 μ M的1-氨基-11-叠氮_3，6，9-三氧杂十一烷，反应l_3h，通过形成酰胺键得到表面修饰了炔基或叠氮基的功能性纳米金溶液。功能性纳米金溶液的制备中，巯基丙酸与炔基或叠氮基的摩尔比为1:1。所述的还原糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖或核糖中的任意一种或多种。所述的纳米金使用柠檬酸钠还原法制备:(I)称取HAuCl4.4H20溶于蒸馏水中，然后移取一定量的HAuCl4溶液加入到烧瓶，剧烈搅拌，加热回流。(2)称取一定的二水合柠檬酸钠配成溶液，用容量瓶定容。(3)在沸腾状态下，用移液器移取一定体积的柠檬酸钠溶液，快速的加入到烧瓶中。(4)溶液由无色变为灰色再到酒红色，继续加热30min，冷却至室温。有益效果:本专利技术利用巯基丙酸修饰纳米金，进而通过酰胺反应分别固定炔基、叠氮基；以还原糖为目标检测物，利用还原糖的还原性将二价铜还原为一价铜，后者充当点击反应的催化剂，促使炔基与叠氮基之间发生环加成反应，从而改变纳米金间距，使纳米金聚集变色。根据纳米金的聚集程度，判断催化剂一价铜的含量，进而实现对生物样品中还原糖的定量检测。该方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，重现性，灵敏度相较于以往还原糖检测手段有明显提高，是一种在食品科学、分析化学、医学等领域中具有广阔应用前景的检测方法。与现有技术相比，本专利技术的优势在于:1、本专利技术操作简单，相对于传统的斐林试剂检测和蒽酮检测，本专利技术的方便快速，无需任何受训的技术人员，具有很好的普遍适用性。2、本专利技术快速高效，整个检测过程在IOmin之内就能完成，大大减少了检测时间和工作量。3、本专利技术实现可视化检测，通过观察纳米金溶液由红变蓝的速度和程度，来可视化辨别样品中还原糖的多少。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术的方案原理图；图2为纳米金表面不同巯基丙酸和炔基/叠氮基的修饰比；图3为不同浓度葡萄糖条件下对应的紫外可见光谱；图4为不同葡萄糖浓度时的吸光度之比；图5功能化的纳米金溶液中只有还原糖没有氯化铜提供催化剂来源和有催化剂来源没有还原糖时的紫外可见光谱。内嵌图中的A、B、C分别与紫外光谱a、b、c 一一对应。裸纳米金呈现酒红色A，其对应 的紫外吸收光谱在520nm处有最大吸收峰a ;含糖以及修饰过炔基和叠氮基的纳米金混合溶液在没有二价铜时，无法发生点击反应，溶液仍旧呈酒红色B，吸收峰基本不变；体系中既含有还原糖又有催本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于点击反应的还原糖定量检测方法，其特征在于先用巯基丙酸修饰纳米金，然后通过酰胺作用在纳米金表面分别固定上炔基和叠氮基，再加入还原糖和新配置的二价铜，通过还原糖还原二价铜到一价铜提供点击反应所需的催化剂，完成叠氮化合物与末端炔基通过环加成反应，从而拉近了纳米金之间的距离，引起纳米金的聚集变蓝；通过检测还原糖的吸光度，实现对样品中还原糖的定量检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，李燕萍，江凌，田丹碧，李霜，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：