一种耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株筛选方法技术

一种耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株筛选方法，属于微生物菌株筛选技术领域。其通过从初始还原糖浓度高达５％以上的除虫链霉菌１００ｈ－１２０ｈ发酵液中分离出除虫链霉菌，并通过高还原糖浓度的平板，然后通过初筛、复筛，最后经过稳定性考察，筛选出耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株。此方法效率高、操作简单，筛选出来的菌株对高还原糖有强耐受性使得该菌不受还原糖浓度不稳定影响；且弥补了阿维菌素补糖工艺操作上的不便，使得其在补糖发酵中具有较大优势，从而在今后的阿维菌素发酵补糖工艺中大幅度提高阿维菌素的产量提供了科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物菌株筛选
，具体涉及一种耐高还原糖浓度的除 虫链霉菌菌株筛选方法。
技术介绍
在除虫链霉菌的发酵过程中，发酵培养基中初始还原糖浓度对生长代谢与产物代谢有较大的影响，高于3%以上的还原糖浓度，对菌体生长和产素有一定 的抑制作用。因此，生产阿维菌素发酵过程中还原糖浓度控制在3%以下。然而，阿维链霉菌在发酵过程中随着代谢的进行，营养物质不断消耗，各 种副产物逐渐积累。在发酵中后期，由于供给菌体的营养物质不断减少，最终 表现效价增长缓慢，菌体代谢差，OUR (摄氧率)和CER (C02稀释率)都有不 同程度的下降趋势。从菌形上看主要表现菌团松散老化、并出现空泡和自溶等 现象。在生化指标上，主要表现可利用的还原糖低(小于1%)，氨基氮含量升高， pH回升等特点。产生这些现象最为重要的一个原因就是由于供给菌体代谢的能 源不足导致。因此，要提高阿维菌素的发酵水平，现有技术主要通过补糖。采 取补糖(葡萄糖，即一种还原糖)工艺是一种最为有效的方法。在除虫链霉菌 发酵过程补葡萄糖实验发现，补糖工艺最大的不足是因除虫链霉菌最佳还原 糖浓度可控范围狭小(从1%-2%)，不易控制，给补糖操作带来不利影响。如 发酵过程中补糖过快导致发酵液葡萄糖浓度过高(大于等于2%)，会导致菌体代 谢流从次级代谢转向初级代谢，菌体生长旺盛，出现二次生长现象，阿维菌素 发酵效价反而降低；若补糖过慢，菌体营养跟不上，代谢物质缺乏，从而菌体 衰老加快，使得补糖效果而不明显。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，设计提供一种耐高还原糖浓度的除虫链霉菌 菌株筛选方法的技术方案。所述的，其特征在于包括 以下步骤(1) 发酵罐中装入发酵培养基，使其装液量达到65-75%，再加入淀粉酶， 12rC灭菌后培养基中还原糖浓度达5. 5-7%，然后按培养基体积3-7%的移种量， 将除虫链霉菌种子液移种至该发酵罐中，在温度27-29°C ，罐压0. 04-0. 06MPa， 转速30-50rpm，通风量1100-1300L/h条件下发酵培养；(2) 发酵100-120小时后，从上述发酵罐中无菌取发酵液，在无菌室中将 取样液稀释成10—2、 l(T、 10—6梯度浓度，然后取不同稀释度的取样液O. lml各涂 布在葡萄糖梯度平板培养基上，取样液每个稀释度在每个葡萄糖梯度下平行涂3 个平板，将上述涂布好的平板在温度27-29。C，湿度40-50%条件下倒置培养2-4天；(3) 从上述的平板中挑取菌株生长良好、菌落多的平板，然后从挑选出来 的平板中挑取单菌落划线接种至斜面培养基，在温度27. 5-28. 5°C，湿度40-50% 条件下，培养7-9天，再从斜面培养基上挖块接种至种子培养基，在温度 27. 5-28. 5。C下，培养39-41小时后取培养液，按发酵培养基体积3-7%的接种量， 接种至发酵培养基，在温度27. 5-28. 5°C，转速200-300rpm条件下培养230-250 小时，然后测定效价，挑选出效价较高的菌株；(4) 将效价较高的菌株划线接种至斜面培养基，温度27.5-28.5°C，湿度 40-50%条件下，培养7-9天，再从斜面培养基上挖块接种至种子培养基，在温 度27.5-28.5t:下，培养39-41小时后取培养液，按发酵培养基体积3_7%的接种量，接种至发酵培养基，在温度27.5-28.5°C，转速200-300rpm条件下培养 230-250小时，然后测定效价，挑选出效价较高的菌株；(5)将步骤(4)中挑选出的效价较高的菌株进行遗传稳定性考察，即通 过斜面培养基传代培养，在温度27. 5-28. 5°C，湿度40-50%条件下，培养7_9 天，得到的各子斜面分别在温度27. 5-28. 5°C，转速200-300rpm条件下发酵培 养230-250小时，然后测定效价，挑选出具有较好遗传稳定性的菌株。所述的，其特征在于斜面 培养基重量配比为酵母膏0. 1%、麦芽糖0. 1%、胰蛋白胨0. 2%、琼脂粉2%， 葡萄糖2%，余量为蒸馏水，并调pH至7.2。所述的，其特征在于所述 的葡萄糖梯度平板培养基重量配比为酵母膏O. 1%、麦芽糖0. 1%、胰蛋白胨0. 2%、 琼脂粉2%，葡萄糖控制在2%、 3%、 4%、 5%、 6%等5个梯度水平，余量为蒸馏水， 并调pH至7. 2。所述的，其特征在于种子 培养基含有玉米淀粉28-32 g/L、玉米浆3-7 g/L、酵母膏13-17 g/L、 KH2P042-6 g/L，余量为蒸馏水，并调PH为7. 0-7. 2;优选为玉米淀粉30 g/L、玉米浆5 g/L、 酵母膏15g/L、肌P(M g/L。所述的，其特征在于发酵 培养基含有玉米淀粉110-130 g/L、酵母粉13-17 g/L、豆粕粉3-7 g/L、花 生饼粉3-7g/L、 KH2P04 3-7 g/L，余量为蒸馏水，并调PH为7.0-7.2;优选为 玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生饼粉5g/L、 K跳5 g/L。所述的，其特征在于步骤 (1)中除虫链霉菌种子液移种时机为当培养在发酵罐中的菌液pH达到6.3-6.7，菌体浓度达到28-32%,移种量为4-6%,发酵条件为温度27.5-28.5°C，罐压 0. 05-0. 06MPa，转速35-45rpm，通风量1150-1250L/h。所述的，其特征在于步骤(2) 中培养条件为温度27. 5-28. 5°C，湿度42-48%，时间3-4天。所述的，其特征在于步骤(3) 中斜面培养条件为接种温度28°C，湿度42-48%，培养8-9天，种子培养 温度为28"C，培养40小时，发酵培养条件为温度28t:，转速250rpm，培养240 小时，最后挑选效价达4500U g/ml以上的菌株。所述的，其特征在于步骤(4) 中斜面培养条件为接种温度28°C，湿度42-48%，培养8-9天，种子培养 温度为28。C，培养40小时，发酵培养条件为温度28。C，转速250卬m，培养240 小时，最后挑选效价达4600ug/ml以上的菌株。所述的，其特征在于步骤(5) 斜面传代培养四代，培养条件为温度28°C，湿度42-48%条件下，培养 8-9天，发酵培养条件为温度28"，转速250rpm，培养时间240小时。本专利技术提供了一种效率高、操作简单的耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株 筛选的方法，本专利技术从初始还原糖浓度高达5%以上的除虫链霉菌100h-120h发 酵液中分离出除虫链霉菌，并通过高还原糖浓度的平板，然后通过初筛、复筛， 最后经过稳定性考察，筛选出耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株。在正常发酵 条件下，筛选得到的菌株产阿维菌素能力比普通菌株高出14%，同时其具有良 好的遗传稳定性，对高还原糖浓度具有较高的耐受性，当还原糖高达5%时，效 价仍能达到4300txg/ml以上，且该菌株弥补了阿维菌素补糖工艺的不足，使得其在补糖发酵中具有较大优势，从而在今后的补糖工艺中大幅度提高阿维菌素 的产量提供了科学依据。具体实施例方式配制培养基普通平板培养基(％):酵母膏0.1，麦芽糖0.1，胰蛋白胨0.2，葡萄糖0.4，琼脂粉2，余量为蒸馏水，并调pH为7.2。葡萄糖梯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐高还原糖浓度的除虫链霉菌菌株筛选方法，其特征在于包括以下步骤：　（１）发酵罐中装入发酵培养基，使其装液量达到６５－７５％，再加入淀粉酶，１２１℃灭菌后培养基中还原糖浓度达５．５－７％，然后按培养基体积３－７％的移种量，将除虫链霉 菌种子液移种至该发酵罐中，在温度２７－２９℃，罐压０．０４－０．０６ＭＰａ，转速３０－５０ｒｐｍ，通风量１１００－１３００Ｌ／ｈ条件下发酵培养；　（２）发酵１００－１２０小时后，从上述发酵罐中无菌取发酵液，在无菌室中将取样液稀释成１０ ↑［－２］、１０↑［－４］、１０↑［－６］梯度浓度，然后取不同稀释度的取样液０．１ｍｌ各涂布在葡萄糖梯度平板培养基上，取样液每个稀释度在每个葡萄糖梯度下平行涂３个平板，将上述涂布好的平板在温度２７－２９℃，湿度４０－５０％条件下倒置培养２－４天；　（３）从上述的平板中挑取菌株生长良好、菌落多的平板，然后从挑选出来的平板中挑取单菌落划线接种至斜面培养基，在温度２７．５－２８．５℃，湿度４０－５０％条件下，培养７－９天，再从斜面培养基上挖块接种至种子培养基，在温度２７．５－ ２８．５℃下，培养３９－４１小时后取培养液，按发酵培养基体积３－７％的接种量，接种至发酵培养基，在温度２７．５－２８．５℃，转速２００－３００ｒｐｍ条件下培养２３０－２５０小时，然后测定效价，挑选出效价较高的菌株；　（４）将效价较高的 菌株划线接种至斜面培养基，温度２７．５－２８．５℃，湿度４０－５０％条件下，培养７－９天，再从斜面培养基上挖块接种至种子培养基，在温度２７．５－２８．５℃下，培养３９－４１小时后取培养液，按发酵培养基体积３－７％的接种量，接种至发酵培养基，在温度２７．５－２８．５℃，转速２００－３００ｒｐｍ条件下培养２３０－２５０小时，然后测定效价，挑选出效价较高的菌株；　（５）将步骤（４）中挑选出的效价较高的菌株进行遗传稳定性考察，即通过斜面培养基传代培养，在温度２７．５－２８．５℃ ，湿度４０－５０％条件下，培养７－９天，得到的各子斜面分别在温度２７．５－２８．５℃，转速２００－３００ｒｐｍ条件下发酵培养２３０－２５０小时，然后测定效价，挑选出具有较好遗传稳定性的菌株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁剑光，储消和，王永红，储炬，蔡群芳，陈中兵，黄海涛，
申请(专利权)人：浙江升华拜克生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]