一种高效液相色谱峰保留时间预测方法技术

本发明专利技术涉及一种高效液相色谱峰保留时间预测方法。该方法包括：测定各种样品的各种成分的标准保留时间，在每个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分，获得双标对照成分在待测样品的供试品溶液中的实测保留时间，获得其他目标成分的实测保留时间，进行两点验证和多点验证等步骤。采用本发明专利技术提供的高效液相色谱峰保留时间预测方法能够准确预测待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，进而对待测样品的色谱峰进行定性，进行待测样品的鉴别。本发明专利技术所提供的方法具有较高的预测精度，适用的色谱柱数量多，明显优于现有的相对保留时间法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。该方法包括：测定各种样品的各种成分的标准保留时间，在每个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分，获得双标对照成分在待测样品的供试品溶液中的实测保留时间，获得其他目标成分的实测保留时间，进行两点验证和多点验证等步骤。采用本专利技术提供的高效液相色谱峰保留时间预测方法能够准确预测待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，进而对待测样品的色谱峰进行定性，进行待测样品的鉴别。本专利技术所提供的方法具有较高的预测精度，适用的色谱柱数量多，明显优于现有的相对保留时间法。【专利说明】
本专利技术涉及，属于高效液相色谱检测
。
技术介绍
中药多指标成分的含量测定、指纹图谱分析，化学药(或抗生素)的有关物质检查等工作中一个核心任务就是对数量众多的目标化合物进行定性，如果均使用纯的化学对照品，将给标准物质的制备和供应带来极大的困难，也会显著提高检测成本。因此使用少量化学对照品通过某种方法来对其他色谱峰进行定性，具有重要的意义和应用价值。目前，使用一个化学对照品的相对保留时间法是最常用的色谱峰定性法，在欧美及中国药典中广泛用于有关物质检查，替代模式的多指标含量测定研究中也多使用。但由于色谱仪与色谱柱的差异，保留时间的预测值与实测值之间的偏差常常较大，实际应用中需限定色谱柱的型号，或选择同类型、分离性能相似的色谱柱，多有不便。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供，通过两个化学对照品进行色谱峰定性，较之相对保留时间法，该方法能够显著减小定性的误差，增加使用的色谱柱数量。为达到上述目的，本专利技术提供了一种高效液相色谱(HPLC)峰保留时间预测方法，可以称为双标线性校正法，其包括以下步骤:(I)利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间，对在不同色谱柱上测定的同一样品的各种成分的实测保留时间两组两组地进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除(色谱柱测定的)r < 0.995的实测保留时间、(色谱柱测定的)偏离较大的实测保留时间以及(色谱柱测定的)导致色谱峰顺序改变的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；或者，以在所有色谱柱上测定的同一样品的同一成分的实测保留时间的平均值为初拟标准保留时间，以所有成分的初拟标准保留时间与所有色谱柱上测定的同一样品的所有成分的实测保留时间分别进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除(色谱柱测定的)r < 0.995的实测保留时间、(色谱柱测定的)偏离较大的实测保留时间以及(色谱柱测定的)导致色谱峰顺序改变的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；(2)在每一个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分；(3)在一根色谱柱上运行待测样品的供试品溶液和双标对照成分的对照品溶液并利用高效液相色谱仪进行检测，获得供试品溶液的色谱图，通过双标对照成分的对照品对所获得的色谱图中的色谱峰进行定性，获得双标对照成分在供试品溶液中的实测保留时间；(4)以双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立线性曲线，并得到两点线性方程；(5)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入所述两点线性方程，获得相应目标成分的预测保留时间，根据该预测保留时间对供试品的色谱图中的其他色谱峰进行定性，得到相应目标成分的实测保留时间；如果所有的除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值均> t2，则预测失败，更换步骤(3)中的色谱柱，并重复步骤(3)- (5)；如果除双标对照成分之外的待测样品的目标成分之中至少有一个目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值< t2，则进入步骤(6)；(6)以所有实测保留时间与预测保留时间的偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立多点关系曲线并得到多点线性方程；(7)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入多点线性方程，计算得到相应目标成分的新的预测保留时间；(8)在供试品的色谱图中找到与新的预测保留时间最接近的色谱峰，得到相应目标成分的新的实测保留时间，并计算各个目标成分的新的实测保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值，以判断多点线性方程是否包括了所有目标成分:如果所有的偏差的绝对值< t2，则进入下一步骤，如果有偏差的绝对值> t2，则返回步骤(6)，以步骤(8)中计算的所有偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标重新建立多点关系曲线并得到新的多点线性方程，重复步骤(6) - (8)；(9)检测所有目标成分的标准保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值是否(tm，其中tm< t2:如果是，则预测成功；如果不是，则预测失败；预测失败时，更换步骤(3)中的色谱柱，重复步骤(3)- (9)。本专利技术所提供的上述方法的目的是为了获得待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，并对色谱峰进行定性，利用两个化学对照品达到对待测样品中多个目标成分的定性，所适用的样品可以为中药、天然植物药、化学药、食品(例如保健食品)或者抗生素等，但不限于此，任何需要通过HPLC进行多成分定性的领域均可以适用。在上述方法中，优选地，在利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根色谱柱上的实测保留时间时，在每一根色谱柱均至少进样3次，并且所得到的实测保留时间的RSD应≤2%。在上述方法中，优选地，所选择的双标对照品成分的标准保留时间靠近对应的样品的目标成分的保留时间段的两端。这里的保留时间段是指各种成分的色谱峰的保留时间范围。在上述方法中，优选地，将样品的目标成分的保留时间段等分为四段，所选择的双标对照品成分的标准保留时间位于第一个分界点和第三个分界点附近。在上述方法中，优选地，选择双标对照品成分的标准保留时间时，不选择在色谱柱拟合过程中偏离较大的成分，并且优选廉价易得的成分。在上述方法中，优选地，t2 < lmin, tm < Imin ;更优选地，t2为0.7min, tm为0.5min。在上述方法中，采用越多的色谱柱进行测定，可以获得更多的数据，而加入的数据越多，误差就越小，但也有一个收益递减效应，优选地，在步骤(I)中，各种成分的标准保留时间时采用的10-20根色谱柱测定的实测保留时间进行计算，由此获得的标准保留时间具有足够的代表性，在一开始选择色谱柱进行实测保留时间测定时应选择较多的色谱柱，以满足这里计算时采用10-20根色谱柱测得的数据的这一要求。根据本专利技术的具体实施方案，上述高效液相色谱峰保留时间预测方法可以按照以下方式进行，其具体流程可以如图1所示:1、色谱柱拟合(I)利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间(至少保留3位小数)，该检测可以采用优化的色谱条件(包括柱温、流速和流动相的种类、比例，可以根据药典的记载进行选择)进行，在检测过程中至少要进样三次，并且要满足保留时间的RSD ( 2%，以控制采集数据的误差；对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效液相色谱峰保留时间预测方法，其包括以下步骤：（1）利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间，对在不同色谱柱上测定的同一样品的各种成分的实测保留时间两组两组地进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除r＜0.995的色谱柱测定的实测保留时间、偏离较大的色谱柱测定的实测保留时间以及导致色谱峰顺序改变的色谱柱测定的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；或者，以在所有色谱柱上测定的同一样品的同一成分的实测保留时间的平均值为初拟标准保留时间，以所有成分的初拟标准保留时间与所有色谱柱上测定的同一样品的所有成分的实测保留时间分别进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除r＜0.995的色谱柱测定的实测保留时间、偏离较大的色谱柱测定的实测保留时间以及导致色谱峰顺序改变的色谱柱测定的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；（2）在每一个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分；（3）在一根色谱柱上运行待测样品的供试品溶液和双标对照成分的对照品溶液并利用高效液相色谱仪进行检测，获得供试品溶液的色谱图，通过双标对照成分的对照品对所获得的色谱图中的色谱峰进行定性，获得双标对照成分在供试品溶液中的实测保留时间；（4）以双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立线性曲线，并得到两点线性方程；（5）将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入所述两点线性方程，获得相应目标成分的预测保留时间，根据该预测保留时间对供试品的色谱图中的其他色谱峰进行定性，得到相应目标成分的实测保留时间；如果所有的除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值均＞t2，则预测失败，更换步骤（3）中的色谱柱，并重复步骤（3）?（5）；如果除双标对照成分之外的待测样品的目标成分之中至少有一个目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值≤t2，则进入步骤（6）；（6）以所有实测保留时间与预测保留时间的偏差的绝对值≤t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立多点关系曲线并得到多点线性方程；（7）将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入多点线性方程，计算得到相应目标成分的新的预测保留时间；（8）在供试品的色谱图中找到与新的预测保留时间最接近的色谱峰，得到相应目标成分的新的实测保留时间，并计算各个目标成分的新的实测保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值，以判断多点线性方程是否包括了所有目标成分：如果所有的偏差的绝对值≤t2，则进入下一步骤，如果有偏差的绝对值＞t2，则返回步骤（6），以步骤（8）中计算的所有偏差的绝对值≤t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标重新建立多点关系曲线并得到新的多点线性方程，重复步骤（6）?（8）；（9）检测所有目标成分的标准保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值是否≤tm，且tm＜t2：如果是，则预测成功；如果不是，则预测失败；预测失败时，更换步骤（3）中的色谱柱，重复步骤（3）?（9）。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙磊，金红宇，马双成，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：