本发明专利技术专利涉及一种生物医药技术，具体是神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，它是按如下步序进行：(1)转基因干细胞构建；(2)脊髓损伤模型制作；(3)斜板实验；(4)开放平面场地实验；(5)工程细胞的标记；(6)细胞移植；(7)组织样本的获取；(8)脊髓损伤面积观察；(9)干细胞在体内的存活观察；(10)干细胞在体内的迁移。本发明专利技术移植至成年脊髓损伤大鼠的转基因干细胞不仅存活、迁移，还可减小脊髓损伤面积，促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。因此，转基因干细胞为运动神经元损伤性疾病如脊髓损伤等提供了一个新的治疗途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物医药技术，特别是一种神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤。
技术介绍
哺乳动物中枢神经系统损伤后，其内源性修复能力是有限的，因为受损的成年中枢神经系统很难产生新的神经元，也不能启动功能性轴突再生。尽管诱导内源性中枢神经系统干细胞分化为神经元是可能的，但就目前的技术水平而言，移植也许是修复受损中枢神经系统更为可行的途径。研究者们已尝试在各种脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型中，移植神经或非神经细胞以及应用某些神经保护剂以促进轴突再生和神经功能的恢复。这些移植的组织或细胞有外周神经、胚胎脊髓组织、雪旺氏细胞、嗅神经鞘细胞、激活的巨噬细胞和小胶质细胞、以及最近的神经干细胞。结合细胞治疗，脊髓内注射糖皮质激素如甲基强的松龙、神经节苷脂、神经营养因子以及各种能降解或阻断抑制轴突生长分子的酶或中和性抗体等也都显示出良好的治疗效果。但这些药物和营养因子在体内会很快降解，因而疗效有限。为此，研究者们已经采用直接体内基因治疗法(in vivo)，即把携带促进脊髓再生的神经营养因子载·体直接注射至损伤部位，使其在局部持续释放营养因子以改变神经再生的微环境。然而携带外源基因的载体很难特异性作用于靶细胞或靶器官，而且载体在体治疗的安全性和效率仍值得评估。最近，基因修饰的非神经细胞如成纤维细胞也已用于移植治疗中枢神经系统疾病，然而这种治疗只局限于移植区，供体细胞不能与宿主细胞相整合，从而难以建立神经环路以调控重要因子的释放，并且基因修饰的非神经细胞也不易稳定表达外源基因。而神经源性的细胞或组织可以增加基因工程细胞的疗效，因此源生于中枢神经系统成熟的或较为年轻的神经元或胚胎组织可能是携带外源基因理想的载体细胞。然而原代培养的神经元不能在体外增殖足够可用于移植的神经元数目。胚胎神经组织存在着来源困难、含有非神经组织和与宿主细胞较少整合等缺陷。相比而言，前已述及的神经干细胞作为载体细胞具有诸多优势。已经证明，转基因的神经干细胞移植体内后，其细胞生物学特性未发生明显改变。目前已有神经营养素-3(NT-3)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、Bcl_2和⑶NF等基因转入神经干细胞,并将之移植到脊髓及脑，治疗效果良好。因此，GDNF基因修饰的胚胎神经干细胞为脊髓损伤的治疗提供了全新的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，具体是将胶质细胞源生神经营养因子基因(GDNF)修饰的胚胎神经干细胞(NSCs)移植于损伤的大鼠的脊髓。脊髓损伤(SCI)模型动物接受干细胞移植4周后，其损伤的脊髓中移植的GDNF-NSCs存活并迁移，空洞面积减小，并使干细胞移植的模型大鼠神经功能得到恢复。这些结果与NSCs移植组比较具有明显差异。同时⑶NF-NSCs可长期存活、适当整合于中枢神经组织且可分化成神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞能并稳定表达外源基因。此法为运动神经元损伤性疾病如脊髓损伤等提供了一个新的治疗途径。附图说明图1是干细胞移植4周后，脊髓损伤动物运动状态与移植前的比较，图2是实验动物的斜板实验，图3是实验动物进行的开放平面场地实验(BBB运动评分法)，图4是实验动物干细胞移植4周后，脊髓损伤面积的比较，图5是移植的干细胞在体内的存活观察，图6是移植的干细胞在体内的迁移。具体实施例方式(I)转基因神 经干细胞制备(见专利技术专利“胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建”，申请号:201210016282.5)，简述之:首先构建目的基因⑶NF与逆转录病毒载体PLNCX2的重组体，包装细胞pT67包装后上清液感染胚胎神经干细胞，经G418筛选获得胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞GDNF-NSCs。(2)脊髓损伤模型制作，按照Tator脊髓损伤制作法:200克清洁级雌性SD大鼠，2%的戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔麻醉动物约15-20分钟，剃去背部T8附近部位的毛发。75%酒精消毒皮肤，切开皮肤、分离肌肉至椎管完全暴露。用咬骨钳咬去T8脊突，沿着T8与T9间的脊间孔咬去椎板，直至脊髓充分暴露。用动脉夹夹击脊髓五秒钟，生理盐水冲洗伤口，缝合肌肉皮肤。再用盐水洗伤口，皮下注射抗菌素(青霉素)3.2万单位、生理盐水和10%葡萄糖液各lml。待动物苏醒(24-28°C动物易苏醒)后送至清洁级动物房每天注射抗菌素和补液(量同上)并作人工护理。图1左侧显示制作的动物模型。(3)斜板实验，动物术后9天，作斜板实验:将动物置于一斜板，让其静止5秒钟。记下斜板与水平面夹角度数。本实验测试指标标准定为:斜板实验不超过33°。图2显示:动物手术后第9天进行斜板实验筛选模型动物，A，斜板实验图；B，细胞移植I个月后，vehicle组、NSCs组和NSCs-GDNF组斜板实验得分比较。三组结果两两比较差异显著(P< 0.05);数据由GLM程序处理，显著性水平为0.05。(4)开放平面场地实验(Open field test)，把手术动物置于一开口圆盆(底部为带条纹的地板)。轻敲盆壁使动物爬行。观察动物的臀、膝、踝关节，以及行走、躯干运动及其协调情况。应用BBB评分法对实验动物逐一评分。动物运动评分不超过3分。20只动物经筛选后有15只动物符合该要求。实验动物术后9天，进行开放平面场地实验。应用BBB运动评分法(图3A)对动物运动状态评分以挑选符合要求的模型动物。本实验系统规定BBB评分不超过3分。vehicle组、NSCs组和NSCs-GDNF组得分分别为:4.2±0.62,6.4±0.80、8.8±0.65。数据经GLM程序处理显示:三组间两两比较差异显著(P < 0.05)，更重要的是转基因神经干细胞组平均得分非常显著地高于Vehicle组(P < 0.01)(图3B)。(5)工程细胞的标记，转基因神经干细胞传代后Pl及野生型的P2吹吸成单个细胞悬液，加入Hochest原液(5μ l/ml),37°C>5% CO2孵育箱孵育I小时。用神经干细胞基础培养液清洗细胞三次。DMEM/F12培养液重悬细胞后在荧光显微镜下观察细胞核标记情况，相差显微镜下计数活细胞数。将活细胞浓度调整为lX104/ml，放入冰中待移植。图5和图6显示:转基因神经干细胞在体内的迁移，Hoechst33342核标记NSCs或NSCs-GDNF移植脊髓损伤动物，4周后收集脊髓标本，组织切片在荧光显微镜下观察发现:H0echst33342核标记细胞或其分化细胞向损伤的头侧和尾侧迁移，迁移的细胞大部分集中在损伤的头尾之间IOmm处。我们发现，Hoechst33342 (+)NSCs或NSCs-GDNF在脊髓损伤处的迁移的距离和细胞数没有明显差异。(6)细胞移植，符合模型动物标准的动物分为三组:对照组(vehicle)注射DMEM/F12培养液；NSCs组移植野生型干细胞；NSCs-GDNF组移植NSCs-GDNF。首先用手术刀片割去覆盖在脊髓损伤部位成纤维细胞增生所形成的结缔组织，使受损部位充分暴露。将微玻璃管固定于立体定位仪，吸取混匀后的4μ1(干细胞含量:lX107本文档来自技高网...
【技术保护点】
神经营养因子基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤，其特征是，它按如下步序进行：(1)转基因神经干细胞制备，将构建的重组逆转录病毒载体pLNCX2?GDNF的质粒包装并感染神经干细胞，制备转基因干细胞GDNF?NSCs。(2)脊髓损伤模型制作，按照Tator脊髓损伤制作法，将大鼠椎管打开夹击并缝合护理，制作脊髓损伤动物模型。(3)斜板实验，术后动物置于一斜板让其静止，记下斜板与水平面夹角度数。(4)开放平面场地实验，手术动物置于一开口圆盆，让动物爬行于其中，观察动物的运动及其协调情况并打分。(5)工程细胞的标记，转基因神经干细胞加入Hochest原液，经孵育、清洗，并于冰中待移植。(6)细胞移植，转基因神经干细胞NSCs?GDNF移植大鼠损伤的脊髓并缝合肌肉、皮肤和护理。(7)组织样本的获取，过度麻醉动物并作心脏灌注，取出损伤的脊髓经固定行冷冻水平切片，黏贴于经铬矾明胶包被的玻片备用。(8)脊髓损伤面积观察，使用免疫酶染色法，将做好的组织片经GFAP单抗染色显示脊髓损伤空洞面积。(9)转基因神经干细胞在体内的存活观察，用免疫组织荧光染色法，把经细胞核染料标记的脊髓标本行神经干细胞标记分子染色，观察移植细胞的存活。(10)转基因神经干细胞在体内的迁移，细胞核染料标记的干细胞在移植大鼠损伤的脊髓4周后的迁移情况。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇，
申请(专利权)人：孙勇，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。