用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法技术方案

本发明专利技术涉及用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，所述载体系统通过以下方法制备：首先通过一种或多种磷脂制备脂质膜，然后将水化的脂质膜超声空化得到微气泡溶液，最后加入抗生物素蛋白和细胞特异性抗体。本发明专利技术还涉及用于将纳米颗粒输入细胞的方法，具体步骤为将纳米颗粒吸附到上述载体系统的微气泡表面上，然后加入经过培养的细胞，最后将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理。本发明专利技术利用微气泡的空化效应将纳米颗粒无损、高效输入细胞内，为纳米生物医学的研究提供安全、方便、准确定量控制各种纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米材料领域，具体地涉及用于在体外或离体状态下通过超声波诱导，利用微气泡的空化效应将纳米颗粒无损、高效输入细胞内，为纳米生物医学的研究提供安全、方便、准确定量控制各种纳米颗粒输入细胞的载体系统及方法。
技术介绍
功能纳米材料对生物医学的影响具有深远的意义，纳米生物医学的发展进程，在很大程度上取决于纳米材料的发展。纳米生物医学应用中纳米材料的种类极其繁多，其具体功能和应用目的也多种多样，如在医学影像对比度增强、组织修复、免疫测定、药物传输和细胞分选等方面有着广阔的应用前景。纳米材料广泛的生物医学应用前景激励着世界各国的研究者对纳米材料的生物学效 应有更深入的认识和操控能力，尤其在细胞层面，因为细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。细胞亦是一个复杂的体系，纳米颗粒进入细胞内的命运、以及对微环境的影响与其能否在生物医学领域应用有着至关重要的影响。纳米颗粒被输送到细胞中的第一步是能够准确到达靶细胞的表面，一旦被输送到细胞表面，纳米颗粒能够跨过细胞膜进入细胞。当前研究纳米颗粒与细胞相互作用的主要方式是共孵育，可利用的纳米颗粒的输运方法的基本技术主要是通过内吞或吞噬机制，在此基础上为了使细胞迅速有效的摄取纳米粒子，亦可通过合理的纳米颗粒表面修饰、纳米化学和纳米颗粒表面连接相关的生物分子等方式实现。然而，这种方法具有特定的特点和限制，在靶细胞培养中实现纳米颗粒的有效输送必须克服一系列的障碍，并避免在靶细胞中产生毒性效果以及能够在细胞中有效传输纳米颗粒以及纳米颗粒装载的功能性成分。如在纳米颗粒与细胞共孵育过程中可能会引起细胞膜破裂，细胞骨架紊乱。还有大量体外研究证实，多种细胞(肾上腺嗜铬细胞瘤、肝癌细胞、肺上皮细胞、巨噬细胞等)吞噬纳米颗粒(如Fe304或Y-Fe2O3等纳米材料)后，细胞内的各种酶的降解会使细胞受到不同程度的损伤，表现为细胞呼吸运动活性降低，分裂分化受阻，细胞凋亡等。因此，有效的输送方法一方面应当保证纳米颗粒更高效聚集到靶细胞膜表面，提高输送效率，还需要调控纳米颗粒进入细胞的途径，从而避免颗粒进入细胞内带来的毒副作用。本专利技术拟制备膜壳表面装载靶向特异性分子的脂质微气泡，然后将纳米颗粒通过静电吸附等方式偶联到微气泡表面，利用微气泡对超声场的特异性响应以及表面修饰的特异性分子靶标，不仅可有效将纳米颗粒输送到靶细胞表面，而且在较高超声能量作用下，微气泡破泡产生空化效应时的瞬时声穿孔可将纳米颗粒无损输送进入靶细胞内，从而增加纳米颗粒进入细胞的效率和安全性，为纳米生物医学研究纳米材料对细胞的作用影响提供一种新的输送载体系统和方法。
技术实现思路
技术问题:有微气泡存在时，生物组织或细胞与超声波的相互作用可出现多种生物学效应。当在低声压(< 0.1MPa)作用下时，微气泡有规律的伸缩振动能对超声波进行回波反射，从而用于微气泡超声显影成像；当在高声压(> 0.1MPa)作用下时，微气泡由于剧烈的伸缩振动而发生破裂，导致微气泡周围的生物组织或细胞出现热效应、声穿孔或声辐照力等生物效应，可将外源性物质瞬时输运进入细胞，实现活细胞的诊断和药物治疗等多种功能。因此，本专利技术制备的微气泡结构可被作为新型的纳米颗粒传输载体系统，实现纳米颗粒高效率、无损输入细胞内，从而在生物医学领域进行应用。本专利技术的目的在于提供一种可携带各种纳米颗粒的微气泡结构，并通过调控体外超声辐射参数条件，为实现纳米颗粒或其携带的生物活性成分高效、无损、安全、靶向输入细胞提供新型载体系统及方法。具体目的包括:(1)制备表面携带特异性靶向分子的脂质微气泡结构，并通过静电作用等将拟输运的纳米颗粒吸附到微气泡结构上；(2)通过超声显影技术监测纳米颗粒在细胞表面的聚集；(3)通过调控体外超声辐照参数条件，控制微气泡的破泡，实现纳米颗粒无损、安全输入细胞。技术方案: 本专利技术的第一方面，用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于:该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备: (1)将选自蛋黄卵磷脂EPC、卵磷脂PC、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC-PEG、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPE-PEG、胆固醇Chol中的一种或多种均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液； (2)将混合液置于旋转蒸发干燥器中蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜； (3)将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡以水化该脂质膜； (4)将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入气体的同时进行超声空化，得到微气泡溶液； (5)使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0°C振荡；再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体，在0°C振荡，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。优选地，所述脂质微气泡呈球状，其粒径为100 ηπΓ5 μ m，更优选为200 ηπΓ μ m0优选地，在步骤(2)中将混合液置于旋转蒸发干燥器中于30°C下蒸发干燥。优选地，在步骤(3)中置于震荡仪中振荡30 min-2 h。优选地，在步骤(4)中超声空化10-60 min，超声空化功率为80-180 W。优选地,在步骤(4)中通入的气体为氮气、氩气、氧气或全氟化碳。优选地，在步骤(5)中加入抗生物素蛋白时在0°C振荡30 min-2 h ;加入细胞特异性抗体时在(TC振荡30 min-2 h。本专利技术所述的抗生物素蛋白和细胞特异性抗体是指生物
中常见的抗生物素蛋白和细胞特异性抗体。抗生物素蛋白包括链霉抗生物素蛋白等，细胞特异性抗体包括血管表皮生长因子(VEGFR)、P-选择素、细胞表面粘附分子(VCAM-1)、新生血管抗体(RGD)、整合素(αν β 3)、叶酸等。上述仅是列举，并不表示对抗生物素蛋白和细胞特异性抗体范围的限制。本专利技术的第二方面，用于将纳米颗粒输入细胞的方法，其特征在于包括以下步骤: A、通过层层自组装正负电荷吸附相互作用或通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛或N-琥珀酰亚胺基-3- (2-吡啶二硫基)丙酸酯将纳米颗粒与微气泡表面化学偶联，将纳米颗粒吸附到上述的用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统的微气泡表面上； B、使用磷酸盐缓冲液洗涤经过培养的细胞，然后加入步骤A的载体系统中，室温放置一段时间后再次使用磷酸盐缓冲液洗涤，得到吸附微气泡的细胞溶液； C、将吸附微气泡的细胞溶液置于超声场中进行超声处理，超声波的发射选用平阵探头或聚焦探头，频率为0.5-10 MHz，声强为0.1-2 MPa。优选地，步骤A所述纳米颗粒为超顺磁纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)、银纳米颗粒、金纳米颗粒或量子点纳米颗粒。超顺磁纳米颗粒主要包括四氧化三铁(Fe3O4)> Y _ 二氧化_■铁(Y - Fe2O3X优选地，步骤C中频率为1-6 MHz，声强为0.5-1.5 MPa。本专利技术所述脂质微气泡作为纳米颗粒输入细胞的载体系统的机理为:微气泡内部包裹的气体赋予了该微气泡具有响应超声波辐射的特性，当微气泡携带纳米颗粒到达细胞表面后，可在低强度超声波辐照条件下进行超声成像观察。同时利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于将纳米颗粒输入细胞的载体系统，其特征在于：该载体系统为脂质微气泡，其通过以下步骤制备：（1）将选自蛋黄卵磷脂EPC、卵磷脂PC、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC?PEG、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPE?PEG、胆固醇Chol中的一种或多种均匀混合于氯仿溶剂中以制备混合液；（2）将混合液置于旋转蒸发干燥器中蒸发干燥，然后置于干燥器中移除痕量溶剂，得到干燥的脂质膜；（3）将干燥的脂质膜加入磷酸盐缓冲液，置于震荡仪中振荡以水化该脂质膜；（4）将水化的脂质膜置于超声空化仪中，向水化的脂质膜中通入气体的同时进行超声空化，得到微气泡溶液；（5）使用磷酸盐缓冲液洗涤微气泡溶液，然后加入抗生物素蛋白，在0℃振荡；再经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入细胞特异性抗体，在0℃振荡，最后再次加入磷酸盐缓冲液进行洗涤，即获得所述载体系统。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨芳，顾宁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：