本发明专利技术公开了一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，包括引物设计、PCR扩增BmGAPDH、BmCPI基因、BmGAPDH、BmCPI基因片段纯化和T载体的连接以及转化、I阳性重组克隆的筛选和鉴定、I重组表达质粒构建与鉴定、重组质粒的大量抽提纯化等步骤。本发明专利技术制备方便，效果好；以我国流行的周期型马来丝虫为研究对象，构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶真核表达重组质粒。试验结果证明了该复合多价DNA疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗获得成功。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种周期型马来丝虫疫苗的制备方法。
技术介绍
丝虫病是一种严重危害人类健康的虫媒病，被联合国开发计划署/世界银行/世界卫生组织共同列为全世界重点防治除疟疾、血吸虫病、利什曼病、锥虫病、麻风病外的六大热带病之一，目前世界上有70多个国家和地区有淋巴丝虫病流行，11亿人口受到感染的威胁。慢性丝虫病主要导致象皮肿、鞘膜积液和乳糜尿等，可使患者不同程度丧失劳动能力，被世界卫生组织列为全球第二位致残性疾病，仅次于精神疾患。全世界淋巴丝虫病人达9千多万，我国是主要受累国家。虽然丝虫病的防治在全球范围内取得了巨大的成绩，但由于气候变暖等自然、生物和社会以及淋巴丝虫的夜现周期性和微丝蝴血症者多无临床症状等诸多因素的广泛存在，近年来在一些国家和地区出现疫情复燃和蔓延的趋势，丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。淋巴丝虫病在我国流行有两千多年历史了，经过多年艰苦的防治工作，国内丝虫病得到一定的控制，但迄今全国仍存在相当数量的丝虫病人，包括江苏省仅有临床表现者就达139万多人。由于淋巴丝虫病传播媒介广泛存在，加之大量外来流动人口的涌入，尤其是沿海经济发达地区，近期各地报道外来务工者中较多微丝蝴阳性者，外源输入的危险因素可加重丝虫病的流行。最新研究报道表明，感染者残存传 染源的微丝蝴血症可持续20年以上，中等密度和较高密度微丝蝴血症者具有传播丝虫病的作用。目前治疗丝虫病的主要方法是采用化学药物，药物虽能降低感染率和发病率，但由于频繁应用，尚不能排除丝虫有潜在抗药性的危险，加上重复化疗和长期的监测措施需要昂贵的费用和大批专业技术人员。因此，为寻找控制丝虫病辅助或替代方法，丝虫疫苗的研究日益成为人们关注的问题。与传统疫苗相比，制备核酸疫苗(DNA疫苗)具有独特的优势和潜能:(I)能够激发机体全面的免疫应答，其保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵抗作用；(2)核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能。联合免疫，即可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备“复合疫苗”或“多价疫苗”的多功能疫苗，达到一次免疫能取得和多次不同免疫相同的免疫效果；(3)核酸疫苗表达的抗原接近天然构象，其递呈过程与自然感染十分相似，抗原性强，因此免疫效果好，免疫应答持久；(4)不存在减毒活疫苗毒力回升的危险，且能引起CTL应答；(5)核酸疫苗既有预防作用，也有治疗作用；(6)制备方便，成本低廉，便于贮藏和运输，干燥的DNA小粒在室温下相对稳定，不需要冷藏设备，核酸疫苗在给予前加水溶解就能简单地恢复原状，因此对边远地区的使用也较为方便，这在经济上和公共卫生方面都是有利的。丝虫为多细胞人体寄生虫，生活史及抗原分子复杂，且在与宿主长期进化的过程中产生了多种免疫逃避机制，所以单价疫苗在体内难以成功地诱导出足够有效的免疫保护力。筛选出有效的具有保护性抗原并进行有机组合，将不同抗原分子设计成联合或将编码不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片段连接起来，采取复合多价疫苗的手段，使疫苗在接种后能刺激机体产生针对不同生活史时期虫体均起作用的特异性免疫反应，这种疫苗将具有多用性和可靠的保护性，是疫苗研制的重要内容和发展方向。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是一种广泛存在于原核生物和真核生物中的生理代谢酶，在生物体的糖代谢中有着重要的作用。寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)作为免疫调节剂具有调节某些细胞因子生成并诱导抗炎症反应的能力。它们在丝虫发育过程中具有多种生理功能，也是重要的显性抗原，使成为疫苗和药物研究的重要靶分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备方便，效果好的周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法。本专利技术的技术解决方案是:—种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是:包括下列步骤:(一)引物设计根据GeneBank中周期型马来丝虫3_磷酸甘油醛脱氢酶基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物，在上下游引物的5'端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，起始、终止密码子以及保护性碱基；BmGAPDH-Pl:上游引物5’-CC GGATCC ACC ATG ATT AAC ATT GAC TAT-3’，下划线序列为BamH I酶切位点BmGAPDH-P2:下游引物 5’-CC CTCGAG TTA GGT TGC TGT AGC CAT AT-3’，下划线序列为Xho I酶切位点根据GeneBank中周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的已知序列,应用Primer Premier5.0软件设计引物，在上下游引物的5’端分别引入Nhe I和BamH I酶切位点，起始终止密码以及保护性碱基；BmCP1-Pl:上游引物 5’ -CC GCTAGC AAC GAT GTC AAT AAA AGA AG-3’，下划线序列为Nhe I酶切位点BmCP1-P2:下游引物 5’ -CC GGA TCC CTA TGC ACC AAT TAA AAC-3’，下划线序列为BamH I酶切位点；(二)PCR 扩增 BmGAPDH、BmCPI 基因计算引物Tm 值，PlTm=62.02，P2Tm=64.94，在 0.5mlEppendorf 管中按下表建立权利要求1.一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是:包括下列步骤: (一)引物设计 根据GeneBank中周期型马来丝虫3-磷酸甘油醒脱氢酶基因的已知序列,应用PrimerPremier5.0软件设计引物，在上下游引物的Y端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，起始、终止密码子以及保护性碱基； BmGAPDH-Pl:上游引物 5’-CC GGATCC ACC ATG ATT AAC ATT GAC TAT-3’，下划线序列为BamH I酶切位点 BmGAPDH-P2:下游引物 5’-CC CTCGAG TTA GGT TGC TGT AGC CAT AT-3’，下划线序列为Xho I酶切位点 根据GeneBank中周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的已知序列，应用Primer Premier5.0软件设计引物，在上下游引物的5’端分别引入Nhe I和BamH I酶切位点，起始终止密码以及保护性碱基；BmCP1-Pl:上游引物 5’ -CC GCTAGC AAC GAT GTC AAT AAA AGA AG-3’， 下划线序列为Nhe I酶切位点 BmCP1-P2:下游引物 5’-CC GGA TCC CTA TGC ACC AAT TAA AAC-3’， 下划线序列为BamH I酶切位点； (二)PCR扩增 BmGAPDH、BmCPI 基因 计算引物 Tm 值，PlTm=62.02, P2Tm=64.94,在 0.5mlEppendorf 管中按下表建立 25 μ I的PCR反应体系:2.根据权利要求1所述的周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是:所述快速连接缓冲液由132mM Tris-HCl、20mM MgC12、2mM DTT、2mM ATP、15%聚乙二醇组成。3.根据权利要求1所述的周期本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种周期型马来丝虫复合多价DNA疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：（一）引物设计根据GeneBank中周期型马来丝虫3?磷酸甘油醛脱氢酶基因的已知序列，应用Primer?Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5′端分别引入BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切位点,起始、终止密码子以及保护性碱基；BmGAPDH?P1:上游引物5“?CC?GGATCC?ACC?ATG?ATT?AAC?ATT?GAC?TAT?3“，下划线序列为BamH?Ⅰ酶切位点BmGAPDH?P2:下游引物5“?CC?CTCGAG?TTA?GGT?TGC?TGT?AGC?CAT?AT?3“，下划线序列为Xho?Ⅰ酶切位点根据GeneBank中周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的已知序列，应用Primer?Premier5.0软件设计引物,在上下游引物的5“端分别引入Nhe?Ⅰ和BamH?Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；BmCPI?P1:上游引物5“?CC?GCTAGC?AAC?GAT?GTC?AAT?AAA?AGA?AG?3“，下划线序列为Nhe?Ⅰ酶切位点BmCPI?P2:下游引物5“?CC?GGA?TCC?CTA?TGC?ACC?AAT?TAA?AAC?3“，下划线序列为BamH?Ⅰ酶切位点；（二）PCR扩增BmGAPDH、BmCPI基因计算引物Tm值，P1Tm=62.02,P2Tm=64.94,在0.5m1Eppendorf管中按下表建立25μl的PCR反应体系：反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45秒，57℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃再延伸7min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；计算引物Tm值，P1Tm=62.01,P2Tm=61.99,在0.5m1Ep管中按下表建立25μl的PCR反应体系：反应体系在冰上调制，混匀，离心后置PCR仪，94℃预变性3min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃再延伸10min，4℃冷却终止反应。扩增完毕后，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；（三）BmGAPDH、BmCPI基因片段纯化和T载体的连接以及转化感受态大肠杆菌的制备：(1)取E.coli?DH5α用接种环划种于1.5%琼脂LB平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；(2)次日，从LB平板上挑一个直径约2mm的单克隆菌落，接种至3ml?LB培养基中,于37℃250rpm振荡培养过夜；(3)取菌液0.3ml加入30m1LB液体培养基中，37℃250rpm振荡4?6小时，使之处于对数生长期,冰浴1h；(4)将培养液分装到1.5ml?Ep管4℃离心，4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L?MgCl2?100μl悬浮，冰浴30min；(5)再于4℃离心,4000rpm×5min，弃上清，加入冰浴0.1mol/L?CaCl2?10%甘油溶液300μl悬浮，?70℃保存备用；纯化BmGAPDH、BmCPI基因片段：(1)取50μl?PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,移入1.5ml预先称重的Ep管中，称胶重；(2)按400μl/100mg琼脂糖凝胶比例加入Binding?Buffer，50℃?60℃水浴10min，使胶彻底融化。加热融胶时，每2min混匀一次；(3)将融化的胶转移到离心柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心l?min；(4)取下离心柱，弃收集管中的废液，将离心柱放入同一收集管中，加入500μl?Wash?Solution，8000rpm室温离心lmin；(5)重复步骤(4)一次；(6)取下离心柱，弃收集管中的废液，空管l2000rpm离心lmin；(7)将离心柱置于新的灭菌1.5ml?Ep管中，在柱子膜中央加入30μl?Elution?Buffer，室温放置2min；(8)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。BmGAPDH、BmCPI基因片段和pGEM?T载体的连接：在一个灭菌0.5ml?Ep管中，建立如下10μl连接体系：在一个灭菌0.5ml?Ep管中，建立如下10μl连接体系：混匀，4℃连接20h，同时设置不含PCR产物的连接反应体系作为阴性对照；pGEM?T/BmGAPDH、pGEM?T/BmCPI连接反应物的转化：（1）取一管贮存于－70℃冰箱的DH5α感受态细胞，冰浴化开；（2）取连接反应物10μl...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方政，王慧，方浩，陆施娟，胡迎青，徐邦生，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
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