实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法技术

一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法：取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；经裂解后的各组细胞进行电泳；对电泳后的各组细胞进行PI染色；在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测实体肿瘤的细胞放射敏感性的方法。
技术介绍
实体肿瘤细胞的放射敏感性检测是研究预测实体肿瘤细胞放射反应性的基础,其前提条件是需先行建立灵敏、稳定、可操作性强的。为此，国外几个主要放射生物研究中心多年来相继开展了预测肿瘤放射敏感性的研究，并陆续推出了一些有潜在价值的检测方法，如SF2 (2Gy照射后的细胞存活分数)、Tpot (潜在倍增时间)、微核率、原代细胞克隆形成分析及细胞黏着分析等。由于这些实验方法操作复杂，稳定性、成功率较低，至今多停留在体外培养细胞水平无法真正用于实体肿瘤活检组织细胞放射敏感性检测。专利技术人经过多年的实践摸索，结合实际对“彗星(Comet)”分析法(Ostling于1984年首先推出的检测外周血及体外培养细胞DNA链断裂的实验方法)不断进行改良研究，终于研发和建立了可用于实体肿瘤活检组织样品细胞放射敏感性检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种可用于实体肿瘤组织样品的细胞放射敏感性检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种，其特征在于，步骤如下:( I)取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；(2)取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；(3)将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；(4)经裂解后的各组细胞进行电泳；(5)对电泳后的各组细胞进行PI染色；(6)在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；(7)对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行测量和数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。如上所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中所述单细胞悬液的制备方法可采用机械研磨法或消化液消化法。如上所述的检测方法，优选地，步骤(3)中所述细胞裂解及漂洗的操作为:将空白对照组照射组的细胞悬液分别与1%低溶点琼脂糖混合后铺在预冷的载玻片上制成琼脂糖胶板；将各胶板在裂解液中裂解50-60分钟，之后漂洗3次。如上所述的检测方法，优选地，取浓度为2-5 X IO4个/mL的细胞悬液0.25mL与1%低溶点琼脂糖0.75mL混合。如上所述的检测方法，优选地，所述裂解液的组成为:lmol/L氯化钠和0.003mol/L十二烷基肌氨酸钠的混合溶液，PH12.8-13.0。如上所述的检测方法，优选地，步骤(4)中所述电泳的操作为:细胞裂解及漂洗后，将所述胶板置于电泳液中进行电泳20分钟；所述电泳液的成分为:2mmol/L的E:DTA和0.03mol/L的NaOH的混合溶液。如上所述的检测方法，优选地，步骤(5)中所述PI染色的时间为20分钟，染色时PI染液的终浓度为3.7 u mol/L。如上所述的检测方法，优选地，步骤(6)中所述肿瘤/正常细胞分类采图的操作为:在荧光显微镜下观察琼脂糖胶板内的受检肿瘤样品细胞，从胶板的左上角起、以之字形顺序、根据细胞核DNA含量对肿瘤细胞和正常细胞进行分类采图，其中肿瘤细胞的DNA含量较正常细胞为大，对肿瘤细胞和正常细胞分别采集100幅以上的细胞图像。如上所述的检测方法，优选地，步骤(7)中所述对图像的数据处理的操作为:对图像进行细胞彗星尾力矩的测量，受检肿瘤样品细胞的放射敏感度等于95%受检肿瘤样品细胞与外参对照细胞的彗星尾力矩差值之比；所述彗星尾力矩，是指细胞图像上彗星尾部的长度与尾部DNA百分数的乘积；所述彗星尾力矩差值，是指照射组细胞的彗星尾力矩值与自身空白对照细胞的彗星尾力矩值的差值；所述的95%受检肿瘤样品细胞，是将占细胞总数5%的坏死细胞的尾力矩值不纳入分析，坏死细胞的尾力矩值体现为极端数值，将之去除以排除干扰。如上所述的检测方法，其中，所述的实体肿瘤组织是指肿瘤鳞癌组织、肿瘤腺癌组织或肿瘤未分化癌组织。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供了一种用于实体肿瘤活检组织样品细胞放射敏感性检测的方法。在“彗星”分析法的改进上，本专利技术方法首先设计并规范了检测过程中系统误差的校正指标和方法；首先设计并建立了对肿瘤样品中混合存在的肿瘤细胞和正常组织细胞进行分别分析放射敏感性的检测方法；并且提供了与本专利技术方法相适应的实体肿瘤样品放射敏感性检测报告的阅读方法。利用本专利技术方法,可在转化研究(translational Res)中，通过定量分析实体肿瘤组织样品细胞的DNA损伤效应，评估实体肿瘤组织细胞的放射敏感性，以得到体外培养细胞检测难以实现的更接近在体肿瘤细胞实际放射反应性的分析结果。通过比较不同实体肿瘤细胞的放射敏感性差异可以阐释各种作用因素(物理/化学/生物)对实体肿瘤放射敏感性的影响及机制，以加深对临床肿瘤个体间放射敏感性差异的理解。附图说明图1为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之一，其中图1A (A1-A8)是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告，图1B (B1-B8)是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图1C(Cl-CS)是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告。图2为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之二，其中图2A (A1-A8)是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图2B (B1-B8)是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告，图2C(C1-C8)是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告。图3为鼻咽癌样品的细胞放射敏感性的分析报告图例之三，其中图3A (A1-A8)是受测样品经分类采图后的正常细胞的分析报告，图3B (B1-B8)是受测样品经分类采图后的肿瘤细胞的分析报告，图3C(C1-C8)是作为外参对照的体外培养的淋巴瘤细胞的分析报告。具体实施例方式本专利技术提供了一种，其主要原理及功效在于:首先，在现有肿瘤细胞放射敏感性检测的实验操作中，实验条件及试剂、仪器设备的稳定与否是构成系统误差的主要原因，因此在本专利技术检测方法中，我们设计了以体外培养的淋巴瘤细胞作为外参对照，以外参对照细胞照射与不照射细胞的尾力矩(TailMoment,TM)差值作为基准指标，以进行实验系统误差的校正(包括试剂、仪器和实验条件等存在的误差)和肿瘤样品细胞放射敏感性分析的阳性参照。数百例的肿瘤样品检测实践证明，这是确保在肿瘤样品细胞放射敏感性检测中降低系统误差对检测结果判断干扰及正确判断受检样品细胞放射敏感性差异的关键因素，这在国内外均未有先例。其次，已知实体肿瘤是异质性非常明显的细胞群体，即正常细胞及不同分化程度的肿瘤细胞交织混合存在。细胞群的细胞异质性对正确判断实体肿瘤放射敏感性具有重要影响。因此，要分析检测肿瘤样品中不同性质和类型的细胞的放射敏感性，首先应对受检细胞群的异质性细胞加以区分，才能实现合理地体现异质性肿瘤细胞群不同细胞的放射敏感性差异，进而恰当分析和预测实体肿瘤的放射敏感性。第三，病理形态学观察显示，受检肿瘤样品中主要包含两类细胞:一类是正常细胞(包括弥散分布的小淋巴细胞及纤维细胞)，另一类是不同分化程度的肿瘤细胞。其中，各个肿瘤细胞的细胞核虽大小不一，但均明显大于正常的淋巴/纤维细胞，荧光染色后DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液；（2）取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射；（3）将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗；（4）经裂解后的各组细胞进行电泳；（5）对电泳后的各组细胞进行PI染色；（6）在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图；（7）对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行测量和数据处理，判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。

【技术特征摘要】
1.一种实体肿瘤细胞放射敏感性检测方法，其特征在于，步骤如下: (1)取受检肿瘤样品组织，制备成单细胞悬液； (2)取体外悬浮培养的淋巴瘤细胞作为外参对照；分别将受检肿瘤样品和作为外参对照的淋巴瘤细胞的单细胞悬液分为照射组和空白对照组，照射组的单细胞悬液均采用5Gy剂量X射线单次照射，空白对照组的单细胞悬液均不进行放射线照射； (3)将各组单细胞悬液进行细胞裂解及漂洗； (4)经裂解后的各组细胞进行电泳； (5)对电泳后的各组细胞进行PI染色； (6)在荧光显微镜下，对受检肿瘤样品的照射组和空白对照组细胞分别进行肿瘤/正常细胞分类采图，同时对外参对照细胞进行采图； (7)对受检肿瘤样品细胞中的肿瘤细胞、正常细胞和外参对照细胞的图像进行测量和数据处理,判断受检肿瘤样品细胞的放射敏感性。2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中所述单细胞悬液的制备方法采用机械研磨法或消化液消化法。3.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞裂解及漂洗的操作为:将空白对照组和照射组的细胞悬液与1%低溶点琼脂糖混合后铺在预冷的载玻片上制成琼脂糖胶板；将胶板在裂解液中裂解50-60分钟，之后漂洗3次。4.按权利要求3所述的检测方法，其特征在于，取浓度为2-5X IO4个/mL的细胞悬液0.25mL与1%低溶点琼脂糖0.75mL混合。5.按权利要求3所述的检测方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：高黎，杨伟志，房超，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，北京大恒图像视觉有限公司，
类型：发明
国别省市：