本发明专利技术公开了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以pVAX1质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。本发明专利技术提供的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂具有显著提升MIC8基因免疫效果的作用，进而，能够显著增强弓形虫免疫预防疫苗的免疫效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫佐剂，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。
技术介绍
弓形虫广泛寄生于多种哺乳动物的有核细胞内，是一种重要的人兽共患性寄生虫病病原，具有发病率高、危害严重的流行病学特点。婴幼儿、孕妇或免疫低下者感染，可引发流产、畸胎或急性获得性弓形虫病等。艾滋病又名获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，研究发现10% 30%艾滋病患者并发弓形虫脑炎，是艾滋病患者死亡的主要原因之一。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，研制疫苗尤其是DNA疫苗已逐渐成为一种较为有效的举措。从1990年WolfT等发现小鼠肌注外源性重组质粒，质粒被摄取并表达出编码蛋白时起，重组质粒的数量和种类已举不胜举，其中近些年，弓形虫重组质粒包括R0P13，ROP16, R0P18，MIC6，MIC8等先后被评价。结果发现，除少数个别基因(如R0P18等)免疫效果较好外，其他重组疫苗均有不理想的特征。为了增强免疫效果，提高免疫保护率，免疫佐剂的研制将成为一个重要的研究课题。按照是否具有免疫原性，免疫佐剂可分为两大类，即具备免疫原性的佐剂如卡介苗，细胞因子等，和不具备免疫原性的佐剂如铝盐佐剂等，或两者的混合形式。其中，白细胞介素(IL)是一种常见的免疫佐剂。IL15是Grabstein于1994年从猿肾上皮细胞系CV-1/EBNA的培养上清液中发现的，它是一种重要的免疫调节因子，属于IL2家族，主要由单核细胞、吞噬细胞和树突状细胞等白细胞产生，能维持依赖IL-2的CTLL细胞系的增殖，同时对⑶8+ T细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞的发育及内环境稳态至关重要。IL15分子包含Cys-35-Cys-85和Cys-42-Cys-88两个二硫键，三级结构含有4个螺旋和3个连接环。IL15受体(IL15R)由3个亚基组成，β、Y亚基与IL2R相同，α亚基为IL15独有。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，IL15引起由IgM交叉耦合 诱导的细胞增殖并抑制细胞凋亡，还可增加Shc和ERK1/2的磷酸化作用，而IL21促进细胞凋亡且不能引起CLL细胞的增殖。IL21是Parrish-Novak首次发现的,属于I型细胞因子,亦是IL-2家族成员。人IL21基因与IL2、IL15定位于同一条染色体上，位于4q26_q27，距IL-2基因大约180 kb,相距IL15则较远，与IL2、IL4、IL15有较高的同源性，鼠IL21与人的IL21有57%的同源性。IL21包含4个螺旋，与IL15有两对相同的Cys位点残基:一对是在IL21和IL15中特有的，另一对在IL2、IL4和GM-CSF中也有表达。IL21具有很强的免疫刺激作用，特别是能够增强并维持CD8+ T细胞应答，已经被证明是很好的免疫增强因子。IL21的信号传导是由IL21受体与IL2受体家族共同的Y c受体组成的异二聚体受体介导的。IL21是启动先天性和适应性免疫应答的辅助细胞因子，并导致免疫应答进一步放大。IL21对机体的细胞免疫和体液免疫具有广泛的调节作用，它可调节T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞的分化和增殖，其中最显著的特征是能持续增强效应T细胞及活化NK细胞的功能，在促进机体由先天性免疫向获得性免疫的转变中起着关键作用。IL21对B细胞的调节主要表现为促进B细胞向浆细胞分化，调节免疫球蛋白的产生。IL21具有增强免疫激活、促进CTL应答和维持记忆性T细胞应答的能力，使其成为癌症免疫治疗最具潜力的候选药物之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案: 一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以PVAXl质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-1L21-1L15，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本专利技术的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在提升MIC8基因免疫效果中的应用。本专利技术的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在增强弓形虫免疫预防疫苗效果中的应用。本专利技术的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在制备弓形虫免疫预防疫苗中的应用。以下为本专利技术的实验内容: 参照弓形虫MIC8基因序列，设计了扩增弓形虫MIC8基因的引物序列。包括:Fmic8:5/ -CGCGGATCCATGAAGGCCAATCGAATATGGTG-3'；Rmic8:5/ -CCGCTCGAGTTAGGACCAGATACCGCCCGAA-3'； 参照小家鼠(ifes musculus) IL15基因序列，设计了 IL15基因引物序列。包括:F15b:5/ -AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3,；R15b:5/ -TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3/ ； 参照小家鼠(ifes musculus、IL21基因序列，设计了 IL21基因引物序列。包括:F21:5/ -CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3'；R21:5/ -AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3,； 弓形虫RH株pVAX-MIC8疫苗的制备； KM鼠pVAX-1L21-1L15免疫佐剂的构建； KM鼠免疫与分组。(一)弓形虫RH株PVAX-MIC8疫苗的制备包括如下顺序的步骤: 1.虫体基因组DNA的提取:弓形虫RH株腹腔接种KM鼠96 h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL, IOOOOrpm离心3 5min，弃上清，备用。弓形虫RH株DNA提取的具体方法和步骤参照 Promega 公司试剂盒 Wizard SV Genomic DNA Purification System 使用说明进行。扩增:以所提取的弓形虫RH株基因组DNA为模板，进行MIC8基因的PCR扩增。MIC8基因PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 lmin，62°C复性Imin ;72°C延伸2min ；35个循环。纯化产物的连接:MIC8 基因PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18_TVector使用说明进行。16°C反应2 4h或4°C连接过夜，连接产物标记为pMD18_MIC8。的序列测定:将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。质粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。载体(图6所示)及MIC8目的片段的回收:用BamHI和XhoI分别双酶切pVAXl质粒及pMD18-MIC8重组质粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明回收载体及目的片段。载体及MIC8目的片段的连接:将经切胶回收纯化得到的MIC8基因片段定向亚克隆至pVAXl载体中。16°C反应4 6h或4°C连接过夜，产物标记为pVAX_MIC8。连接产物的转化与鉴定:将连接产物10 μ L转化大肠杆菌DH5a中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。pVAX-MIC8构建路线参照附图说明图1。(二)KM 鼠 pVAX-1L21-1L15 重组质粒的构建 1.KM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，其特征在于，它是以pVAX1质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX?IL21?IL15，其碱基序列如SEQ?ID?NO:?1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，其特征在于，它是以PVAXl质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒PVAX-1L21-1L15，其碱基序列如SEQ ID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱兴全，李中原，陈佳，徐民俊，周东辉，黄思扬，宋慧群，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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