具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法技术

本专利公开具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，以银杏叶为原料，通过非极性溶剂提取，分子蒸馏分离，再经柱层析，重结晶，纯化得到8个化合物(依次为异植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、胡萝卜苷)和聚戊烯醇以及银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分。本专利制备的8个化合物和聚戊烯醇以及银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分对于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉菌具有抑制作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物医药领域。
技术介绍
银杏叶为银杏科银杏属植物银杏(Ginkgo biloba L.)的叶，近年来国内外学者对银杏叶中黄酮类、萜内酯、多糖、聚戊烯醇、挥发油及留醇的化学成分进行了广泛研究。银杏叶类脂成分主要有烃类、聚戊烯醇类、萜烯醇类、留醇类等化合物，它们极性相似，较难分离；银杏叶类脂成分主要是以油状物形态存在，在低温下通常有白色结晶物析出，根据报道主要是留醇类成分。银杏叶留醇的报道主要是通过气质联用(GC-MS)技术来对其混合物的各自化学结构进行研究。我们利用分子蒸馏技术，将银杏叶类脂成分分离后得到的轻馏分，通过裂解-气质联用(Py-GC-MS)分析，其中单萜、倍半萜类化合物GC含量约为23%，长链醇(酮、酯)及二萜类相对含量约为47%，烷基酚、留体类GC含量约为30%;重馏分中主要成分为聚戊烯醇，含量在80%以上。一些分子量大、沸点高的化合物以及受到色谱分离条件和质谱分析等限制，通过GC-MS、HPLC-MS不能完全准确的确定其各自化学结构，因此对银杏叶类脂成分的分离，以及利用核磁共振(NMR)等技术对其结构鉴定，对弄清楚该化学部位的化学成分是十分有必要的。已报道的银杏叶抑菌活性成分主要是黄酮、酚酸类等成分，即主要为水溶性和醇溶性的化学部位，脂溶性成分特别是类脂成分抑菌活性报道甚少。
技术实现思路
为实现上述目的，专利技术了，由以下步骤组成:第一步，银杏叶类脂软膏的制备:取干燥粉碎银杏叶粉(直径0.25 5毫米以下)，加入丙酮或石油醚(60 90°C)或乙酸乙酯或无水乙醇的任一种溶剂，银杏叶粉与溶剂质量比为1: 5 50 ;30 75°C加热回流提取，时间2 8h，重复3次或以上提取；合并提取液，回收溶剂，得银杏叶脂溶性成分软膏；加I 15% NaOH或KOH的甲醇或乙醇溶液，软膏与溶剂比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C热回流搅拌，搅拌速度为20 200r/min,时间0.5 5h，得到皂化液；加入丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯的任一种溶齐U，皂化液与溶剂比1: 2 10 (V/V)，合并提取液，回收溶剂，从而得到银杏叶类脂总不皂化物。第二步，银杏叶类脂成分的分子蒸馏分离方法:取银杏叶类脂总不皂化物，放于O _40°C下冷冻结晶I 5h，取出后迅速抽滤，得到结晶物；滤过的油状物通过刮膜式分子蒸馏装置分离，刮膜转速100 300r/min，蒸馏温度120 250°C，在高真空条件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，轻组分以气体状态径直飞向中间冷凝器并凝结成液体，进入轻馏分收集器，得到轻馏分；重组分沿筒体内壁进入重馏分收集器，得到重馏分。第三步，银杏叶类脂成分的色谱分离方法:将第二步中所得的结晶物与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(100% 85%: O 15%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；100%三氯甲烷馏分，挥干溶剂后用异丙醇或无水乙醇或乙腈在5 -20°C下，反复重结晶得到化合物4(β-谷甾醇乙酸酯)；三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)馏分，挥干溶剂后上Sephadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(30 50%: 70 50%，VN)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(30 35%: 70 65%，V/V)馏分，挥干溶剂后用环己酮或丙酮在O -20°C下，反复重结晶得到化合物5(β -谷留醇)，剩余物挥干溶剂后用正戊醇或正丁醇在5 -10°C下，反复重结晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物挥干溶剂后用乙醚在O -20°C下，反复重结晶得到化合物7 (麦角留醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%, V/V)馏分，挥干溶剂后用三氯甲烷或无水乙醇在O -20°C下，反复重结晶得到化合物8(胡萝卜苷)；第二步中所得的轻馏分与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 90%: O 10%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%,V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(100% 85%: O 15%，￥八)，36511111紫外光下显色，取1^值在0.50 0.65处硅胶，用乙酸乙酯或无水乙醇萃取，低温挥干溶剂得到化合物I (异植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%，V/V)馏分，挥干溶剂后上S印hadex LH-20柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇(40 50%: 60 50%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取三氯甲烷/甲醇(40 45%: 60 55%，V/V)馏分，低温挥干溶剂得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%, V/V)馏分，挥干溶剂后用荧光(GF254)硅胶薄层制备板制备，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(95% 75%: 5 25%，￥八)，36511111紫外光下显色，取1^值在0.40 0.55处硅胶，用乙酸乙酯或无水乙醇萃取，低温挥干溶剂得到化合物3 (芳樟醇)；将第二步中所得的重馏分与硅胶G按质量比1:1充分混合磨细，上硅胶柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯(100% 95%: O 5%，V/V)体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)馏分，挥干溶剂后加入质量比为1: 5 15丙酮或乙酸乙酯，室温搅拌溶解；然后将其与活性炭与硅藻土按质量比1:1 5混合的吸 附剂，按固液质量比为1: 10 100混合，在-40°C 30°C搅拌4 20小时，1000 10000转/分钟离心后过滤，上清液回收溶剂后即为纯化后的聚戊烯醇类脂。本专利技术中所得的化合物I 8，依次为异植物醇(抑菌圈范围9.9-13.4μ g/mL，MIC, MBC 和 MFC 值依次为 31.3 μ g/mL, 62.5-125 μ g/mL, 125 μ g/mL)、橙花叔醇(抑菌圈范围 16.2-20.1 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 3.9-15.6 μ g/mL, 31.3-5-62.5 μ g/mL, 62.5 μ g/mL)、芳樟醇(抑菌圈范围 14.9-17.9 μ g/mL, MIC, MBC 和 MFC 值依次为 7.8-31.3 μ g/mL, 62.5 μ g/mL, 31.3 μ g/mL)、β -谷甾醇乙酸酯(抑菌圈范围10.9-11.7 μ g/mL, MIC 和 MBC 值依次为 62.5 μ g/mL，250 μ g/mL)、β-谷甾醇(抑菌圈范围12.1-14.1 μ g/mL, MIC和MBC值依次为31.3 μ g/mL，125 μ g/mL)、豆甾醇(抑菌圈范围7.7-9.2 μ g/mL, MIC和MBC值依次为125μ g/mL，> 250 μ g/mL)、麦角甾醇(抑菌圈范围8.1-10.0 μ g/mL，MIC和 MBC 值依次为 62.5-125 μ g/mL,彡 250 μ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征包括银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分以及化合物1～8(依次为异植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β?谷甾醇乙酸酯、β?谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、胡萝卜苷)和聚戊烯醇类脂成分的制备及抑菌活性。

【技术特征摘要】
1.有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征包括银杏叶类脂总不皂化物、类脂结晶物、类脂轻馏分和类脂重馏分以及化合物I 8 (依次为异植物醇、橙花叔醇、芳樟醇、β_谷留醇乙酸酯、β_谷留醇、豆留醇、麦角留醇、胡萝卜苷)和聚戊烯醇类脂成分的制备及抑菌活性。2.根据权利要求1所述具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征在于化合物I 8制备方法包括下几个步骤: 第一步，银杏叶类脂软膏的制备:取干燥粉碎银杏叶粉(直径0.25 5毫米以下)，加入溶剂Al，银杏叶粉与溶剂质量比为1: 5 50 ;30 75°C加热回流提取，时间2 8h，重复3次或以上提取；合并提取液，回收溶剂，得银杏叶脂溶性成分软膏；加1 15%溶液BI，软膏与溶剂比1: 2 15 (kg: L)，采用30 75°C热回流搅拌，搅拌速度为20 200r/min,时间0.5 5h，得到皂化液；加入溶剂Cl，皂化液与溶剂比1: 2 10(V/V)，合并提取液，回收溶剂，从而得到银杏叶类脂总不皂化物。 第二步，银杏叶类脂成分的分子蒸馏分离方法:取银杏叶类脂总不皂化物，放于O _40°C下冷冻结晶1 5h，取出后迅速抽滤，得到结晶物；滤过的油状物通过刮膜式分子蒸馏装置分离，刮膜转速100 300r/min，蒸馏温度120 250°C，在高真空条件下(真空度大于等于1.0 X IO5)，轻组分以气体状态径直飞向中间冷凝器并凝结成液体，进入轻馏分收集器，得到轻馏分；重组分沿筒体内壁进入重馏分收集器，得到重馏分。第三步，银杏叶类脂成分的色谱分离方法:将第二步中所得的结晶物与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；100%三氯甲烷馏分，挥干溶剂后用溶剂B在5 _20°C下，重结晶得到化合物4(β- 谷甾醇乙酸酯)；馏分三氯甲烷/甲醇(99%: 1%, V/V)，挥干溶剂后上C色谱柱，用洗脱剂三氯甲烷/甲醇体系洗脱，挥干溶剂后用溶剂D在O -20°C下，重结晶得到化合物5(β -谷甾醇)，剩余物挥干溶剂后用溶剂E在5 -10°C下，重结晶得到化合物6 (豆留醇)，剩余物挥干溶剂后用溶剂F在O _20°C下，重结晶得到化合物7 (麦角甾醇)；三氯甲烷/甲醇(90%: 10%,V/V)馏分，挥干溶剂后用溶剂G在O -20°C下，重结晶得到化合物8(胡萝卜苷)；第二步中所得的轻馏分与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱(粒径0.04 0.1mm)，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪；石油醚/乙酸乙酯(95%: 5%, V/V)馏分，挥干溶剂后用填料H薄层制备板制备，Rf值在I处，得到化合物I (异植物醇)；石油醚/乙酸乙酯(92%: 8%,V/V)馏分，挥干溶剂后上C色谱柱，得到化合物2 (橙花叔醇)；石油醚/乙酸乙酯(90%: 10%，V/V)馏分，挥干溶剂后用填料H薄层制备板制备，Rf值在J处，得到化合物3(芳樟醇)；将第二步中所得的重馏分与填料A按质量比1:1充分混合磨细，上填料A柱，用洗脱剂石油醚/乙酸乙酯体系洗脱，收集的馏分用薄层色谱碘蒸气显色跟踪，取石油醚/乙酸乙酯(99% 97%:1 3%，V/V)馏分，挥干溶剂后加入质量比为1: 5 15溶剂K，室温搅拌溶解；然后将其与吸附剂L，按固液质量比为1: 10 100混合，在_40°C 30°C搅拌4 20小时，1000 10000转/分钟离心后过滤，上清液回收溶剂后即为纯化后的聚戊烯醇类脂。3.根据权利要求2所述具有抑菌活性的银杏叶类脂成分的制备方法，其特征在于第一步中溶剂Al为丙酮或石油醚(60 90°C )或乙酸乙酯或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成章，陶冉，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：