GLP-1类似物的反相HPLC纯化制造技术

本发明专利技术包括应用反相高效液相层析（RP-HPLC）来纯化GLP-1肽类似物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类似物的纯化，特别涉及用于纯化具有SEQ ID N0.1 的氨基酸序列的 GLP-1 类似物的方法:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser_Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,其中，这些氨基酸中的26个氨基酸是天然L构型，而4个氨基酸是非手性构型。Aib表示通过反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化的人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的α-氨基异丁酸类似物。该肽也称为(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，并在PCT公布TO 2000/34331 中描述了其药物用途及其通过固相肽合成(SPPS)的制备。
技术介绍
可遵循这样的混合方法合成GLP-1类似物，所述混合方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液中的片段偶联。例如，PCT公布WO 2007/147816描述了通过制备三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。各合成步骤一般是高选择性的，然而，在多步化学合成结束时，产物通常不纯，不足以用作药物。因此，粗产品可以经过反向高效液相层析(RP-HPLC)来进一步纯化肽并获得96至99%(面积)范围内的纯度。经RP-HPLC阶段后，通常获得一般具有I到15%(w/w)肽浓度的溶液形式的产物。`为了获得适合于药物制剂的干燥终产物，溶液可以进行沉淀、冻干或喷雾干燥技术。已在本领域广泛描述了用于人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的RP-HPLC纯化。例如根据PCT公布WO 2007/147816, GLP-1类似物进行了两步RP-HPLC方法；在pH 2下进行第一步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和少量TFA组成的混合物A和由四氢呋喃(15%)、乙腈(70%)、水(15%)和少量TFA组成的混合物B作为流动相，并且在pH 8.8下进行第二步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物A，和由含四氢呋喃(15%)、乙腈(60%)、水(25%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物B作为流动相。由于四氢呋喃倾向于形成过氧化物，因此在大规模上洗脱液对于RP-HPLC是至关重要的。EP-Bl 1664 109公开了利用pH缓冲的醇，特别是乙醇作为洗脱剂来纯化胰高血糖素样肽的RP-HPLC方法，由此pH值范围可以设定在pH 4和pH 10之间，但不能与pH设定点差别超过+/_1.0pH单位。为了获得所需纯度，因此本方法需要严格的pH控制。然而，发现以乙醇作为洗脱剂时，无法获得想要的纯度，特别是无法有效去除杂质des-Ser17, Ser18-[Aib8’35]hGLP-1 (7-36)NH2。因此，本专利技术的目标在于开发RP-HPLC方法，其在技术规模上易于应用，并且在溶剂方面安全并能够提供具有极好纯度的GLP-1溶液。专利技术详述发现利用如下文概述的本专利技术的方法能够实现该目标。应用反向高效液相层析(RP-HPLC)纯化GLP-1肽类似物的方法包括以水性缓冲液和有机溶剂的混合物用于洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且用PH值在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。水性缓冲液为含防止pH变化的缓冲剂的水溶液。根据所用的缓冲剂，该缓冲液可以是酸性的或碱性的。术语“GLP-1肽类似物”包含天然人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类似物GLP-1 (7-37)和 GLP-1 (7-36) NH2 和 GLP-1 肽的合成类似物(GLP-1 类似物)。优选的GLP-1类似物为具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列的人GLP-1类似物:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,即(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，和如 PCT 公布 WO 2000/34331 中描述的其它类似物。特别感兴趣的是(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。短的形式指通过缺失I至6位氨基酸残基、在C末端酰胺化并由α-氨基异丁酸(Aib)取代第8位(Ala)和第35位(Gly)中天然存在的氨基酸残基而在形式上来源于天然人GLP-1 (1-37)的类似物。GLP-1 肽的合适的类似物还可以选自 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36) NH2, (Gly8)GLP-1 (7-37)、(Gly8) GLP-1 (7-36)、(Ser34) GLP-1 (7-37), (Val8) GLP-1 (7-37), (Val8, Glu22)GLP-1 (7-37)、(N- ε - ( Y -Glu (N- α -十六酰基)))-Lys26Arg34-GLP-1 (7-37) (Liraglutide)和D-Ala8Lys37-(2-(2-(2-马来酰亚胺基丙酰氨基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP-1(7-37)(CJC-1131)。GLP-1肽的又一类似物可以是选自以下的exendin类似物:exendin_3、具有根据SEQ ID N0.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2的氨基酸序列的exendin_4(依泽那太)exendin-4 酸、exendin-4 (1-30)、exendin-4 (1-30)酉先胺、exendin-4 (1-28)、exendin-4 (1-28)酉先胺、14Leu, 25Phe exendin-4 酉先胺和 14Leu, 25Pheexendin_4 (1-28)酉先胺以及AVE-0010，其为具有根据SEQ ID N0.3的氨基酸序列的exendin类似物:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_LyS-NH2 ο附1a: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，ρΗ=9.2 ；Kromasil C18 100-16 ;乙醇(100%)。附图说明图1b: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，ρΗ=9.5 ；Kromasil 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.21 EP 10166602.21.应用反向高效液相层析(RP-HPLC)纯化GLP-1肽类似物的方法，所述方法包括用水性缓冲液和有机溶剂的混合物进行洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且使用pH在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。2.权利要求1的方法，其特征在于乙腈还与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。3.权利要求2的方法，其特征在于使用99/1(v/v)至80/20(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚的混合物。4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述碱性缓冲液选自乙酸铵或碳酸氢铵。5.权利要求1至4中任一项的方法,其特征在于以IOmMol至25mMol的浓度使用所述碱性缓冲液。6.权利要求1的方法，其特征在于第一个层析步骤的水性有机溶剂为乙腈并且使用pH在1.0至4.0之间的酸性缓冲液进行第一步层析。7.权利要求6的方法，其特征在于所述酸性缓冲液为磷酸铵。8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于使用硅胶吸着剂作为固定相进行所述RP-HPLC。9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述GLP-1肽类似物选自由GLP-1 (7-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·卡尔，M·罗特，C·萨拉丁，D·斯特鲁布，F·维克斯，
申请(专利权)人：益普生制药股份有限公司，
类型：
国别省市：