本发明专利技术属于生物医药技术领域，目前尚无文献报道有关青环海蛇的生物活性肽的报道。本发明专利技术提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，所述的青环海蛇抗炎活性肽，具有如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还提供了Hydrostatin-SN1的编码基因，以及青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SN1及其编码基因在制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的应用，与TNF-α相关的疾病，包括类风湿性关节炎、糖尿病、冠心病、败血症、结肠炎等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病。本发明专利技术具有较大的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因和在制药中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF-a，又称TNF)是一种主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞分泌的细胞因子。对于不同的细胞类型，TNF能够引起多样化的生物学效应，这暗示了其在多种生理和药理条件下都具有重要的调控作用。此外，TNF-a还是凋亡过程(程序性细胞死亡)中的关键性调控因子之一。TNF-a作为一种多效的细胞因子，在细胞再生、迁移、炎症和凋亡等生物学过程中都具有作用。随着研究的深入，TNF-a在风湿性关节炎、哮喘、败血症、结肠炎乃至糖尿病、冠心病等多种复杂炎症疾病或免疫性疾病中所起的关键性作用逐渐为人们所知并日益受到重视。作为一种多效的细胞因子，TNF-a介导的生物学响应都是通过TNF-a与其两种受体的结合而触发的。这两种受体分别为TNFRl (又称TNFRSF1A、CD120a、p55)和TNFR2 (TNFRSF1B, CD 120b, p75)。其中，胞内域中含有死亡结构域(death domain, DD)的TNFRl属于TNF受体超家族中的死亡受体亚群；而TNFR2的胞内域不含该结构。在机体内，TNF-a引起的炎症或免疫反应，主要是通过TNFRl信号通路发挥作用。虽然有研究表明TNFR2能够增强TNFRl信号通路的生物学效应，甚至能够独自激活TNFRl弓丨发的大部分信号通路，但其更重要的功能是调控机体的增殖与再生。近年来，以抗TNF-a抗体治疗自身免疫性炎症疾病如类风湿性关节炎等已取得了重大进展，进一步证明TNF`在该类疾病中的重要作用。作为一种多效的细胞因子，TNF在机体内的功能还涉及了细胞增殖、修复及迁移等生物学功能，因此TNF-a抗体在使用过程中往往表现出一定的毒副作用，如对英国风湿病学会生物制剂注册数据库的数据进行分析，发现使用TNF拮抗剂治疗风湿性关节炎的患者比正常人和使用常规药物的患者感染结核病的概率要高，其中使用infliximab和adalimumab的患者患病的概率比使用etanercept的患者高三到四倍(参见文献Dixon WG, Hyrich KL, Watson KD etal.Drug-specific risk of tuberculosis in patients with rheumatoid arthritistreated with ant1-TNF therapy:results from the British Society for RheumatologyBiologies Register(BSRBR) [J]. Ann Rheum Dis, 2010;69: 522 - 528)。因此，结合前述内容研究开发一种以TNFRl为靶点的药物已愈发重要。据统计，全世界蛇类有2700多种，其中毒蛇有600多种.我国的蛇类资源丰富，约有200多种，其中毒蛇约为48种。作为一种成分复杂功能、多样的天然药物宝库，蛇类毒素中有效成分的分离及功能研究一直备受关注。研究表明，蛇毒中的活性成分主要为蛋白质和多肽，按照功能可分为酶、神经毒性多肽、神经生长因子、膜活性多肽及其他生物活性肽(参见文献王艳妮，鲍毅新。蛇毒的研究进展及其在医药领域的应用[J]，浙江师范大学学报(自然科学版)，2012，35 (2) :189-194)。随着病理学、药理学、生物化学及分子生物学的发展，蛇毒中的许多活性组分得到了分离纯化，而它们在抗炎、镇痛及抗肿瘤等方面的功效也日益受到关注。青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)属于爬行纲海蛇科,分布于我国辽宁、江苏、浙江、福建、广东、广西和台湾近海。作为一种药用动物，于唐朝陈藏器的《本草拾遗》中就有对其作为祛风燥湿，通络活血，攻毒和滋补强壮等功效良药的记载。目前有关青环海蛇活性成分的文献介绍的都是复方提取物，如复方海蛇酊、海蛇药酒，海蛇提取物等。目前尚无文献报道有关青环海蛇的生物活性肽的报道，更没有有关青环海蛇的生物活性肽与TNF-a相关的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl及其编码基因，本专利技术的另一目的在于提供该青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl在制药中的应用。本专利技术人以TNFRl为靶点淘选青环海蛇毒腺噬菌体展示文库筛选获得得到一种蛇毒活性小肽Hydrostatin-SNl。对其进行深入研究，发现该活性小肽能够有效阻遏肿瘤坏死因子I型受体介导的生物活性，具有极大的药用前景。本专利技术的主要技术方案是，以TNFRl为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库筛选获得蛇毒抗炎活性小肽，并对其抗炎能力进行研究。本专利技术的第一方面 ,提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl,所述的青环海蛇抗炎活性肽，具有如下(a)或(b)或(C)的蛋白质(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO: 2的氨基酸序列经过1-17个氨基酸残基的取代或缺失且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质；(c)将SEQ ID NO: 2中的氨基酸序列在N端或C端加上1_10个氨基酸残序列，且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质。本专利技术还提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl的编码基因，为如下(i )或(ii )的DNA分子( i )如 SEQ ID NO:1 所示的 DNA 分子；( ii )在严格条件下与(i )限定的DNA序列杂交且编码所述青环海蛇抗炎活性肽的DNA分子。所述的一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl,具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，是一种直链多肽，分子量为2483. 68道尔顿，等电点4. 39。本专利技术的第二方面，提供了一种青环海蛇抗炎活性肽Hydrostatin-SNl的筛选方法，该方法包括如下步骤(I)生物淘选以TNFRl作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库用PH9. 6的碳酸盐包被缓冲液将TNFRl稀释至浓度为I U g/ml,以lOOyl/well包被96孔ELISA板，并以封闭剂封闭各孔；包被好的ELISA板，每孔加入IOOyl噬菌体，37°C孵育I小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37°C孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下来，并以宿主菌BLT5403扩增洗脱下的噬菌体，完成第一轮淘选。按上述方法以第一轮淘选所得噬菌体为基础，再进行两次淘选，获得强亲和力的含目的基因的噬菌体群。从第三轮淘选所得噬菌体中分离单克隆噬菌体，以up和down引物扩增，测序鉴定后获得 Hydrostatin-SNl 的基因序列5’ -GACGAACAAC ACCTAGAGAC CGAACTACACACTCTCACCA GCGTGCTGAC AGCCAATGGA TTCCAA-3’ (如 SEQ ID NO:1 所示)；其氨基酸序列一级结构为Asp-Glu-Gln_His-Leu-Glu-Thr-Glu-Leu-Hi s-Thr-Leu-Thr-Ser-Val-Leu-Thr-Ala-Asn本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽具有如下(a)或(b)或(c)的蛋白质：(a)由SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列经过1?17个氨基酸残基的取代或缺失且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ?ID?NO:2衍生的蛋白质；(c)将SEQ?ID?NO:2中的氨基酸序列在N端或C端加上1?10个氨基酸残序列，且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ?ID?NO:2衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽具有如下(a)或(b)或(C)的蛋白质 (a)由SEQID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQID NO:2的氨基酸序列经过1-17个氨基酸残基的取代或缺失且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质； (c)将SEQID NO: 2中的氨基酸序列在N端或C端加上1_10个氨基酸残序列，且与青环海蛇抗炎活性肽相关的由SEQ ID N0:2衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的一种青环海蛇抗炎活性肽，其特征在于，所述的青环海蛇抗炎活性肽具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，是一种直链多肽，分子量为2483. 68道尔顿，等电点4. 39。3.—种如权利要求1所述的青环海蛇抗炎活性肽的编码基因，其特征在于，该编码基因为如下(i )或(ii )的DNA分子 (i )如SEQ ID NO:1所示的DNA分子； ( )在严格条件下与(i )限定的DNA序列杂交且编码所述青环海蛇抗炎活性肽的DNA分子。4.一种如权利要求2所述的青环海蛇抗炎活性肽的筛选方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (A)生物淘选以TNFRl作为靶点淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将TNFRl稀释至浓度为I μ g/ml，以100 μ 1/well包被96孔ELISA板，并以封闭剂封闭各孔；包被好的ELISA板，每孔加入100 μ I噬菌体，37°C孵育I小时；以TBST溶液洗板4次，加洗脱液于37°C孵育20分钟，从ELISA板上将结合的噬菌体洗脱下...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆一鸣，郑增节，王俊杰，胡振林，厉建中，张俊平，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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