本发明专利技术提供一种从人退变椎间盘软骨终板中分离、纯化出具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性相似，经诱导能向骨、软骨及脂肪等方向分化，而且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。软骨终板干细胞经动物体内试验证实其具有显著的髓核再生能力和阻止椎间盘退变的作用，且不存在明显免疫排斥反应，在椎间盘退变性疾病的生物治疗中具有良好的应用前景和价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人退变椎间盘软骨终板干细胞在临床治疗椎间盘退变性疾病及其它生物治疗中的应用。
技术介绍
下腰痛是临床常见病和多发病，是引起劳动力丧失和残疾的最常见病因之一。一般认为椎间盘退行性改变是引起下腰痛最常见的原因，因此对椎间盘退行性疾病的预防和治疗具有重要的意义。目前椎间盘退变相关疾病的治疗手段主要包括保守治疗、手术治疗和生物治疗。保守治疗为对症治疗，以缓解症状为目的，属于阶梯治疗的第一步。椎间盘髓核摘除术或脊柱节段融合内固定等手术治疗方式只是解决了椎间盘突出所致的神经受压及脊柱节段不稳的问题，不能从根本上解决椎间盘退行性改变。此外，单纯椎间盘髓核摘除会引起椎间隙塌陷，脊柱节段不稳从而产生腰痛等症状，且有一定的复发率；内固定的使用会加速邻近椎体节段的退变，从而产生新的临床症状。因此，手术治疗的长期效果仍然不是十分理想，而且治疗费用高，手术所带来的相关并发症较多。目前，生物治疗方式包括基因治疗、生长因子治疗、细胞治疗和组织工程等。椎间盘退行性疾病的生物治疗作为一种新兴的治疗手段，还没有普遍应用于临床，但是生物治疗的应用前景广泛，有望成为手术治疗和保守治疗的有效补充，延缓甚至逆转椎间盘退变的生物学过程，以改善患者的临床症状。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从人退变椎间盘软骨终板中分离、纯化出具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞与骨髓间充质干细胞生物学特性相似，能向骨、软骨及脂肪等方向诱导分化，而且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。其具体特征为①在标准的培养条件下能贴塑料瓶壁生长；②细胞表面标志物能表达CD105、CD73、⑶90，不表达⑶45、⑶34、⑶14或⑶lib、⑶79alpha或⑶19及HLA-DR表面分子；③在体外培养能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞方向分化。本专利技术还提供一套较为完整的人软骨终板干细胞获取、筛选、纯化和扩增方法，包括以下步骤步骤1:制定标本来源的病例纳入标准经患者知情并同意，年龄小于70岁，大于40岁；无结核、肝炎、肿瘤、糖尿病等传染性疾病及自身免疫性疾病；行颈椎、胸椎和腰椎融合手术。步骤2 :将手术中遗弃的软骨终板标本，在无菌条件下用解剖显微镜对软骨终板标本进行分离，去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核，剩下透明状的软骨终板。机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞，并以台盼蓝测定细胞活力。将获取到的原代细胞置37°C、5%C02、95%湿度条件下孵箱培养，倒置相差显微镜每天观察细胞生长情况，每3天换液1次。步骤3 :将长满近90%培养瓶的软骨终板干细胞用胰蛋白酶消化传代时，以琼脂糖筛选系统筛选干细胞，挑选细胞克隆，置培养于培养瓶置37°C、5%C02孵箱培养扩增、传代。步骤4 :将传至第3代的干细胞进行冻存备用，需要应用时将该细胞复苏。步骤5 :复苏后，将该细胞体外培养扩增，将生物学性能稳定的细胞复合海藻酸钠，术中X线引导下向目标椎间盘穿刺注射。本专利技术提供了人软骨终板干细胞在防止椎间盘退变性疾病的应用，主要可应用治疗的疾病范围包括1.椎间盘源性腰痛或椎间盘源性颈肩痛病例，经磁共振及椎间盘封闭等手段可明确责任椎间盘。2.腰椎间盘或颈椎间盘髓核摘除术后病例，术后残留腰痛及颈肩痛且可以明确手术椎间盘为责任椎间盘。3.其它可以采用人软骨终板干细胞治疗的椎间盘退变性疾病。将上述干细胞复合海藻酸钠凝胶植入新西兰大白兔退变椎间盘模型中，六个月后观察检测结果，发现该细胞支架复合物能够显著阻止椎间盘的退变，且髓核再生能力明显 强于骨髓间充质干细胞组。此外，该动物实验属于异种移植，组织学检测未见明显免疫排斥反应。综上所述，椎间盘软骨终板干细胞经动物体内试验证实其显著的髓核再生能力，且不存在明显免疫排斥反应。因此，软骨终板干细胞在椎间盘退变性疾病的生物治疗中具有良好的应用价值。附图说明图1所示为人软骨终板大体标本。图2所示为人软骨终板干细胞相差显微镜下形态。图3所示为琼脂糖筛选系统中软骨终板干细胞集落。图4所示为流式细胞术检测软骨终板干细胞免疫标志物结果。符合国际细胞治疗学会(the International Society for Cellular Therapy, ISCT)所定义的间充质干细胞(MSCs)标准。图5所示为人软骨终板干细胞在相应的诱导液诱导下,能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化。图5A为非诱导对照组，茜素红染色不着色，而诱导组经茜红素染色着色，证实有骨矿化结节生成。图5B为非诱导对照组经油红O染色不着色，图5E为诱导组油红O染色着色，证实有脂滴形成。图5C为非诱导细胞团，阿利新蓝染色不着色，图5F为诱导后细胞团，阿利新蓝染色呈蓝染，证实有细胞团内有大量蛋白聚糖产生，经诱导后的细胞具有软骨细胞的生物学性能。图6所示为软骨终板干细胞与骨髓间充质干细胞体外进行细胞聚集成团试验，等量细胞经诱导向软骨细胞分化，分别在第1，2，3周时，都显示软骨终板干细胞比骨髓间充质干细胞所成细胞团更大，显示的分泌的蛋白聚糖更多，成软骨的能力更强。图7所示为分别植入人骨髓间充质干细胞-海藻酸钠复合物组、人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物组和海藻酸钠植入组术后第6月磁共振检查结果图(箭头所指为手术椎间盘，箭头以上为正常对照椎间盘)。可见人软骨终板干细胞组手术椎间盘信号强度(亮度)及髓核再生能力明显强于骨髓间充质干细胞组，而单纯海藻酸钠植入组中实验椎间盘显著退变，磁供振T2信号显著降低，且邻近的下位椎间盘也信号强度降低，发生退变。图8所示为人骨髓间充质干细胞-海藻酸钠复合物组、人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物组和单纯海藻酸钠植入组在植入手术后第6月X线检查结果图(箭头所指为手术椎间盘，箭头以上为正常对照椎间盘)。可见人软骨终板干细胞组维持椎间隙高度的能力强于骨髓间充质干细胞组，而单纯海藻酸钠植入组中实验椎间盘显著退变，椎间隙变窄，且临近椎间盘也发生高度丢失。图9示X线引导下行椎间盘穿刺注入人软骨终板干细胞-海藻酸钠复合物模式图，此图为椎间盘造影病例。具体实施例方式本专利技术公开了人软骨终板干细胞的制备及其临床治疗的应用。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施进行了描述，来实现和应用本专利技术技术。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术 实施例1人退变软骨终板干细胞的获取及筛选纯化将手术中遗弃的椎间盘标本，无菌状态下在无菌操作台紫外灯照射30分钟杀菌，以含1%庆大霉素的磷酸盐缓冲液漂洗标本组织直到无血迹，在解剖显微镜下对椎间盘标本组织进行分离，去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织，用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核组织，剩下透明状的软骨终板。眼科剪将剩下的软骨终板剪至ImmX ImmX Imm大小，将剪醉的组织用O. 25%11型胶原酶于37°C消化6小时或先于摇床I小时，再于37°C消化4小时。将软骨终板组织消化液经孔径为IOOum或200目的滤网过滤，滤液在1000转/分钟条件下离心5分钟，所得沉淀用含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基洗涤3遍，再以该培养基悬浮细胞，吹打使其成单细胞悬液，取IOul细胞悬液以怠盼蓝测定细胞活力。剩下的细胞悬液接种于培养瓶，在37°C、5%C02、95%湿度条件下孵箱培养，倒置相差显微镜每天观本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人软骨终板干细胞，其是从人退变椎间盘软骨终板中分离出的具有多向分化潜能的干细胞，其特征在于:①在标准的培养条件下能贴塑料瓶壁生长；②细胞表面标志物能表达CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19及HLA?DR表面分子；?③在体外培养能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞方向分化，且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。
【技术特征摘要】
1.一种人软骨终板干细胞，其是从人退变椎间盘软骨终板中分离出的具有多向分化潜能的干细胞，其特征在于①在标准的培养条件下能贴塑料瓶壁生长；②细胞表面标志物能表达 CD105、CD73、CD90，不表达 CD45、CD34、CD14 或 CDllb、CD79alpha 或 CD19 及 HLA-DR 表面分子；③在体外培养能向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞方向分化，且较骨髓间充质干细胞表现出更强的成骨和成软骨分化能力。2.权利要求1所述干细胞的制备方法，其包括以下步骤步骤1:对软骨终板标本组织进行分离获得软骨终板，用机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞，体外扩增时并筛选、纯化，将获取到的细胞置孵箱培养，每3天换液I次；步骤2 :待细胞融合达90%时，对软骨终板细胞消化传代，运用琼脂糖筛选系统筛选细胞，得到较高纯度的软骨终板干细胞，再置于孵箱培养，进行扩增；步骤3 :将传...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄博，王海，周跃，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：
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