一种用高效液相色谱测定白芍愈伤组织中白芍双苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种用高效液相色谱测定白芍愈伤组织中白芍双苷的方法，包括以下步骤：1）色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用乙腈和质量百分数为0.02%~1%的磷酸钾水溶液，两者体积比为11：84~94，流动相的流速为0.5mL/min~2mL/min；检测波长为220nm~240nm；柱温为10℃~35℃；2）测定：将白芍愈伤组织制成的样品溶液注入高效液相色谱仪，按步骤1）的色谱条件测定，同步测定白芍愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含量。本发明专利技术方法具有测定结果准确、检测过程快速、方便，时间短，操作简单等优点，为白芍愈伤组织培养和分析控制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学方法领域，特别涉及一种用液相色谱法同步检测白芍愈伤组织中白芍双苷各自含量的方法。
技术介绍
白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，是常用中药材之一，具有收敛止血、消肿生肌、养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗之功效。白芍的主要有效成分为芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷等单萜苷类，其中芍药苷和芍药内酯苷合称为白芍双苷，是白芍提取物中的主要有效成分。现代药理实验表明，白芍双苷具有多途径抑制自身免疫反应，以及抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多种药理作用，对类风湿性关节炎有确切疗效，以白芍双苷为主要成分的白芍总苷胶囊已用于类风湿性关节炎的临床治疗。 传统的白芍双苷生产方法是从中药材白芍中提取。由于芍药种植时间长、白芍药材中白芍双苷含量低，导致白芍双苷的生产量低、生产成本高，白芍双苷的应用受到了限制。为了解决这一问题，人们目前已开始尝试通过芍药愈伤组织的大规模培养来进行白芍双苷的规模化制备。为了了解不同的愈伤组织培养条件对愈伤组织中白芍双苷含量的影响、确定最有利于白芍双苷产生的愈伤组织培养条件，有必要准确测定白芍愈伤组织中白芍双苷的含量。高效液相色谱是一种常用的测定方法，它具有分析速度快，样品用量少，灵敏度高的优点。目前，已有人采用高效液相色谱法来测定白芍药材中白芍双苷含量的测定，以评判白芍的品质、了解芍药种植和炮制条件的优劣，指导白芍的加工、销售和使用。例如，文献“超高效液相色谱法同时测定白芍中芍药苷和芍药内酯苷的含量”(中南药学2012年2月第10卷第2期，第98 100页)公开了一种采用高效液相色谱法同时测定白芍中芍药苷和芍药内酯苷的含量的方法，采用以下色谱条件色谱柱=Agilent EXTEND-C18 (4. 6nmX50mm,1.8 μ m);流动相:乙腈(A) -O. 2%乙酸溶液(B);梯度洗脱:0 2· 5min，8% 12%A，2. 5 lOmin，12% 20%A ;流速0. 5mL .mirT1 ;检测波长230nm ;温度30°C ;进样量4μ L。配制对照品溶液和供试品溶液，在上述的色谱条件下，该技术方案可在8min内实现对白芍中芍药苷和芍药内酯苷两种物质含量同时测定。但迄今为止，在国内外还未见测定白芍愈伤组织中白芍双苷含量的方法。由于白芍愈伤组织的培养条件完全不同于芍药白芍的生长条件，愈伤组织的性质与白芍存在较大差异，白芍愈伤组织中各种物质的组成、含量也与白芍中物质的组成和含量存在不同，利用这些以检测白芍中白芍双苷含量为目标的方法来测定愈伤组织中白芍双苷的含量时发现物质的分离度差、检测效果不佳，说明这些方法不适用于愈伤组织中白芍双苷的检测。因此，建立一种应用高效液相色谱法测定白芍愈伤组织中芍药双苷的含量的方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术提供了，检测过程快速、方便，时间短，操作简单。，包括以下步骤I)色谱条件色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用乙腈和质量百分数为O. 02°/Γ %的磷酸钾水溶液，两者体积比为11 :84、4，流动相的流速为O. 5mL/mirT2mL/min ；检测波长为220nnT240nm ;柱温为10°C "35°C ；2)测定 将白芍愈伤组织制成的样品溶液注入高效液相色谱仪，按步骤I)的色谱条件测定，同步测定白芍愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含量。虽然
技术介绍
中的文献所公开的方法(以下简称“对比方法”)和本专利技术都采用了反相色谱对芍药苷和芍药内酯苷的含量进行检测，但两者间存在实质性差别。具体体现在以下几点对比方法采用的流动相是乙腈(A) -O. 2%乙酸溶液(B)，本专利技术方法采用的是乙腈(A) -O. 02°/Γ %的磷酸钾水溶液(B)。与O. 2%的乙酸相比，O. 02°/Γ %的磷酸钾水溶液具有更好的PH值缓冲能力，在样品的pH值发生较大范围的波动时，采用O. 02°/Γ %的磷酸钾水溶液可以更好地保持流体体系的PH值稳定性，而pH值的稳定可以使各物质的洗脱能力保持稳定，从而使检测结果具有更好的重现性，从而能更准确地比较不同样品中白芍双苷含量的高低；对比方法采用的流动相洗脱方式为梯度洗脱，即在洗脱的不同阶段，流动相A和流动相B的比例不同；而本专利技术方法采用的流动相洗脱方式为淌洗，即在洗脱的整个阶段，流动相中A和B的比例保持不变。一般说来，采用梯度洗脱可以获得比淌洗更好的分离效果，多用于成分复杂、难以有效分离的样品。对比方法由于采用乙酸作为流动相，对样品的PH值调控能力较差，因此，需要采取梯度洗脱；而本专利技术由于采用了磷酸钾水溶液作为缓冲液，不仅可以保证检测体系的PH值稳定性，而且钾离子的存在还可以使检测峰的峰型更尖锐、分离度更高，因此，只需要采用淌洗就可以达到满意的分离效果。这不仅从另一个方面表明了本专利技术方法在流动相选择上优于对比方法的流动相，而且也可以使检测变得更简单。众所周知，采用梯度洗脱时，必须采用至少两个泵才能实现，因而所用的高效液相色谱仪必须至少配备二元泵；而采用淌洗时，只需配备一元泵即可。因此，本专利技术方法对检测设备的要求更简单，可以在最简单的设备条件下实现对白芍愈伤组织中白芍双苷含量的准确检测，应用更为方便。作为优选，步骤I)中，采用的流动相洗脱方式为淌洗，本专利技术由于采用了磷酸钾水溶液作为缓冲液，不仅可以保证检测体系的PH值稳定性，而且钾离子的存在还可以使检测峰的峰型更尖锐、分离度更高，因此，只需要采用淌洗就可以达到满意的分离效果。流动相采用乙腈和质量百分数为O. 02% 1%的磷酸钾水溶液，两者体积比为11 84、4，该流动相的pH变化范围为4. (Γ4. 8，可以保证检测体系的pH值稳定性。作为优选，步骤I)中，色谱柱采用4. 6mmX250mm、粒度为5μπι的十八烷基硅烷键合硅胶柱，使用该种具体型号的色谱柱具有较好的检测效果，测试的精密度、稳定性较好。步骤2)中，所述的样品溶液的制备具体包括取白芍愈伤组织检测样品粉末用纯甲醇或质量百分数709Γ99. 99%的甲醇水溶液浸溃后，再在40°C 80°C下超声处理15 45min后，在800(Tl2000rpm (转/分钟)离心l(T30min，取上清液经O. 15^0. 3 μ m的微孔滤膜滤过，得到样品溶液。经过上述方法制备的样品溶液能够更好地保证检测精密度，并且，检测稳定性较好，从而有利于测定白芍愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含量。所述的白苟愈伤组织检测样品粉末由白苟愈伤组织检测样品经过研磨制成。所述的白芍愈伤组织检测样品应做广义的理解，并不仅限于白芍愈伤组织，所述的白芍愈伤组织检测样品包括白芍愈伤组织干品以及白芍愈伤组织制成的食品、保健品和药物。所述的白芍愈伤组织干品通过白芍愈伤组织在70V 90°C的烘箱内烘干制得，该烘干条件能够较好地保留白芍愈伤组织中的芍药苷和芍药内酯苷，并能够起到烘干的作 用。进一步优选，I)色谱条件色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用乙腈和质量百分数为O. 05%的磷酸钾水溶液，两者体积比为11 :89，流动相的流速为lmL/min ;检测波长为230nm;柱温为 25 °C。该色谱条件能够提高同步测定白芍愈伤组织中白芍双苷的含量的检测精密度，并且使得检测具有更好的稳定性和重复性。进一步优选，所述的样品溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用高效液相色谱测定白芍愈伤组织中白芍双苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）色谱条件：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相采用乙腈和质量百分数为0.02%~1%的磷酸钾水溶液，两者体积比为11：84~94，流动相的流速为0.5mL/min~2mL/min；检测波长为220nm~240nm；柱温为10℃~35℃；2）测定：将白芍愈伤组织制成的样品溶液注入高效液相色谱仪，按步骤1）的色谱条件测定，同步测定白芍愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江海龙，冯定军，俞伟，梅乐和，胡升，代冬梅，周海滨，
申请(专利权)人：宁波立华制药有限公司，浙江大学宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：