一种细菌纤维素连续增厚的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，在细菌纤维素静置培养过程中，通过调节培养容器的密闭空间和透氧材料下方的空气压力与氧气体积浓度，并在所述密闭空间的内部上方均匀喷淋发酵培养液，实现细菌纤维素厚度的连续增长，明显提高纤维素的产率，制备过程简便，绿色环保，并能够降低规模化生产时的成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌纤维素的培养方法，特别是涉及。
技术介绍
对于纤维素生物合成的研究有着诸多报道，其中通过革兰氏阴性，原核细胞类的木醋杆菌生物合成得到的纤维素具有产率高、纯度高的优点而被选为细菌纤维素发酵培养的模板菌种。木醋杆菌生物合成纤维素的过程可以分为细胞内小分子聚合形成β-1，4-葡萄糖大分子链与细胞外微纤丝逐步、层次化“自组装”形成纤维素network网状结构两个过程。细菌纤维素独特的生物合成过程使其在内部结构上具有“层次化”的特点首先，纤维素丝束(断面直径600nm Ιμπι)中的晶区微纤丝(断面直径7nm)之间的缝隙相当于一根根极细的毛细管，能够源源不断地将亲水小分子吸入细菌纤维素内部，在晶区之间形成无定型区。这赋予了细菌纤维素超强的吸湿能力，能够吸收自重700倍甚至更多的水分；其次，由刚性的β -1, 4-葡萄糖大分子链通过分子内与分子间氢键结晶形成的微纤丝使细菌纤维素具有良好的力学强度。通过碱液与丝束内部无定型区的水在高浓度向低浓度渗透作用下，使微纤丝分子内分子间氢键的重排，再经过热压干燥处理，使得丝束内部的晶区增大，微纤丝之间氢键结合位点明显增加，能够大大提高BC薄膜的力学强度，杨氏模量最高可达15GPa ;第三，木醋杆菌具有极强的氧气依赖特性，纤维素network结构形成于氧气与培养液气液两相界面处。利用这种生物特性，能够通过静置培养得到一系列不同形状的细菌纤维素材料。这三大结构上的特征，使细菌纤维素能够作为基材制成伤口敷料、造纸、声学振膜、透明材料等产品，在生物医 学、食品、半导体、日用品等多个领域获得广泛的应用。但是，细菌纤维素在静置培养阶段的产率较低，规模化制备成本高昂是目前细菌纤维素产业化面临的主要瓶颈。关于提高细菌纤维素产量的研究，至今已取得了许多成果。日本科学家提出“两步法”高效制备椰果产品通过前期动态培养，使细菌细胞体积浓度在短时间内上升两个数量级，随后将高密度的菌液转接入浅盘进行静置培养，大大缩短了培养周期，同时得到的椰果果片表面平整，脱水收缩的现象也大有改善。研究人员受此启发，设计了例如气升式、转鼓式、转盘式等一系列动态培养装置来培养细菌纤维素。据文献报道，现有细菌纤维素动态培养得到的产量能够达到12.6g/7天。动态培养的方式在产量上能够弥补静态培养的不足，但是所得到的细菌纤维素外形多为絮状、团簇状、球形、星形等形状，直接利用价值较低。此外，通过转盘式发酵罐得到的细菌纤维素均质性 (Homogeneity)较差,培养后期随着细菌纤维素膜厚度增加，会从转盘上脱落，培养液中的丝絮状纤维素会缠绕在转动轴上，使机器无法转动。从根本上说，“两步法”依然属于静态培养范畴，提高的只是单批次细菌纤维素膜的产量，批次与批次之间存在着较长的“零产量”时间(也称为“Dead time”)。由于发酵培养液上方空气对于细菌纤维素内部network结构的扩散作用，使得细菌纤维素内部存在着有氧区(aerobiczone),该区域很小,厚度不超过Imm,但是80%的纤维素是由处于有氧区内部的细菌所生物合成的。细菌纤维素膜下方的培养液在“毛细作用”趋势，不断被吸入细菌纤维素内部，形成“碳源区”。“有氧区”与“碳源区”产生重叠，则细菌纤维素得以连续形成。 随着细菌纤维素膜的厚度增加，下方培养液不足以向上渗透至靠近上表面的“有氧区”，宏观上体现为纤维素产量逐渐下降并最终停止生长。因此，如何有效的延长“有氧区”与“碳源区”产生重叠的时间，是细菌纤维素连续生产的关键。本专利技术通过调节与细菌纤维素上表面和下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，同时在培养过程中向细菌纤维素上表面喷淋发酵培养液，在细菌纤维素的上表面和下表面分别形成“有氧区”与“碳源区”的重叠，并延长有效重叠的时间，实现了细菌纤维素连续增厚培养。
技术实现思路
本专利技术涉及。在现有技术的基础上，通过增加与细菌纤维素膜上表面相接触的空气压力，增强气体对细菌纤维素膜的扩散作用，使细菌纤维素内部靠近上表面的有氧区增大；同时在容器底部采用透氧材料向细菌纤维素下表面进行供氧，氧气渗透通过透氧材料与细菌纤维素下表面相接触并产生扩散，使细菌纤维素下表面也存在“有氧区”。本专利技术通过双面供氧的方式，将细菌纤维素内部“有氧区”提高至现有公开技术的两倍以上，能够明显提高纤维素的产率。作为优选的技术方案如上所述的，所述的细菌纤维素是由木醋杆菌在静置培养条件下，与细胞内通过在酶的催化作用下，将小分子葡萄糖以β -1, 4-糖苷键相互键合，聚合形成β -1, 4-葡萄糖大分子链，由细胞体侧面的“终端合成物(Terminal complex)”挤出细胞体外。β -1, 4-葡萄糖大分子链在分子内与分子间氢键作用下，聚集并结晶形成纤维素微纤丝(纤维素微晶，断面直径约7nm)，微纤丝进一步形成丝带(Ribbon， 断面直径约125nm)、丝束(Bundle,断面直径约600nm Ιμπι)。在细菌细胞无规则折线形运动与细胞分裂两种现象同时存在的情况下，纤维素丝束交织形成纤维素network网状结·构，最终形成细菌纤维素。本专利技术还提供，包括以下步骤I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05、. 5，酵母膏O. 05、. 5，柠檬酸O. θΓθ. 1，磷酸氢二钠0. 02、. 2，磷酸二氢钾 ο. οΓο. 1，余量为水；发酵培养液的pH为4. O 6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105 2X107个 /ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，液面高度不宜超过5cm，放置于恒温培养环境内，28 32°C静置培养；通过在培养过程中调节与细菌纤维素上表面相接触的空气压力与氧气体积浓度以及与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力与氧气体积浓度，结合在静置培养过程中向细菌纤维素上表面均匀喷淋调配好的发酵培养液来实现细菌纤维素的厚度连续增长；所述的连续增长分为三个阶段a.细菌纤维素生长诱导期控制与细菌纤维素上表面相接触的空气压力为I个标准大气压,与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1.1个标准大气压，下限高于I个标准大气压范围内，同时保持空气流通，直至细菌将培养液中溶解的氧气消耗殆尽，培养液上表面与透氧材料上表面均出现一层半透明的细菌纤维素薄膜；b.细菌纤维素快速增长期控制与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触的空气压力为I个标准大气压，氧气体积浓度为10 15% ;控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的空气压力在上限不超过1. 2个标准大气压，下限高于I个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10 15%。直至培养液上表面与透氧材料上表面的细菌纤维素薄膜厚度达到O. 5 1. 5mm ;c.细菌纤维素平稳增长期平稳生长期分为两个阶段第一阶段维持与培养液液面上方细菌纤维素薄膜上表面相接触空气压力在上限不超过1. 2个标准大气压下限高于I个标准大气压范围内，氧气体积浓度为10 15% ;控制与培养容器底部透氧材料下表面相接触的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌纤维素连续增厚的培养方法，其特征是：在细菌纤维素静置培养过程中，培养容器为上部是密闭空间且底部是透氧材料的容器；调节所述培养容器的密闭空间和透氧材料下方的空气压力与氧气体积浓度，并在所述密闭空间的内部上方均匀喷淋发酵培养液，实现细菌纤维素厚度的连续增长。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王华平，杨敬轩，李喆，陈仕艳，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：