本发明专利技术涉及应用于人类健康的生物技术领域。在本发明专利技术中描述了用于皮下或肌内施用的疫苗载体，其中来自真核生物的毒素被包囊在具有多个脂质层的脂质体中，所述脂质体通过脱水/再水化的方法来获得，并且其脂质组成为以1∶1的摩尔比的二棕榈酰磷脂酰胆碱∶胆固醇。这些组合物不需要使用其他佐剂。所描述的组合物使得可能调节针对共包囊在包含该毒素的脂质体中的一种或多种抗原的特异性的CTL免疫应答。由于其所诱导的免疫应答的稳固性和功能性以及其免疫调节特性，本发明专利技术的疫苗载体具有相对于现有技术所描述的其他疫苗载体而言的优点。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及应用于人类健康的生物技术的领域。特别地，本专利技术涉及基于脂质体的用于皮下以及肌内使用的疫苗载体 ，所述脂质体包含海葵溶细胞素(Sticholysin)并且增强特异于抗原的细胞免疫应答，该疫苗载体在癌症的免疫疗法和在由细胞内病原体引起的疾病的治疗中是有用的。现有技术很久以来就知道脂质体囊泡的免疫佐剂能力。存在于在免疫接种中和在疫苗设计中使用脂质体方面的合理性基于其在抗原呈递细胞(APC)中释放抗原分子并刺激免疫应答的能力。脂质体作为免疫佐剂的最主要的优点概括如下(i)模拟病原体将大量抗原运输至APC的能力，(ii)将抗原与免疫刺激分子一起共包囊的可能性，(iii)在以更大功效为目的来修饰其物理化学特性方面的灵活性，和(iv)其是生物可降解的和非毒性的这一事实(Leserman, Journal of Liposome Research, 2004，14(3&4)，175-189)。疫苗学领域中的一个挑战是增强特异于抗原的由⑶8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞免疫应答，这与由细胞内病原体和肿瘤细胞诱导的疾病的预防和治疗相关。月旨质体囊泡可以增强CTL应答但并非总是有效。已设计了各种不同的基于脂质体囊泡的策略，以便使该功能更高效；它的实例为对于内体的酸性PH敏感的脂质体，阳离子脂质体，将免疫调节剂例如CpG和细菌来源的成孔性毒素包含在内。尽管有着各种各样的出版物，但这些策略中的一些在诱导有效的细胞免疫应答方面具有有限的成功或者存在缺点，因此在其应用之前需要更好的设计。将病毒膜蛋白整合到脂质体膜中以便促进在酸性pH或蛋白酶解加工的条件下的膜融合，已成为用于开发疫苗载体的另一个选择。这些称为病毒体(virosome)的囊泡不仅被用作亲代病毒疫苗，而且还被利用作为用于结合或包囊至病毒体的疫苗抗原的载体(Zurbriggen，Vaccine, 200314; 21 (9-10) :921_4)。已知具有首字母缩写IRIV(免疫增强性重建流感病毒体(immunopotentiating reconstituted influenza virosomes))的病毒体颗粒(其包含流感病毒的包膜的蛋白质和脂质)是该策略的最好代表，并且构成针对甲型肝炎的疫苗的那篇专利(专利号US5，565，203)的基础。但是，该疫苗制备物被设计为增强针对甲型肝炎病毒的中和抗体的应答。将灭活的和高度纯的甲型肝炎病毒固定在病毒体膜中有利于来自典型的MHCII途径的肽的加工和呈递，这由于在APC中病毒体膜和内体膜的融合过程而造成(Gliick 和 \V’inti，Dev Biol(Basel), 2000, 103，189-97)。所描述的证据表明，抗原-病毒体的物理联合在免疫佐剂性中是重要的(Zurbriggen等人，Progr. in LipidRes. , 2000, 39 (I), 3-18 ；Amacker 等人，Int TmmunoI. , 2005, 17 (6), 695-704)。Schumacher 等人(Vaccine22:714-723，2004)报告，IRIV 也能够增强由细胞介导的免疫应答。特别地,Schumacher等人证明了其在体外诱导CTL中的佐剂活性。该能力主要依赖于对于病毒蛋白质特异的CD4+T细胞反应性的刺激。然而，虽然将病毒体作为佐剂进行使用具有许多优点例如低毒性和高免疫原性，但在目前的病毒体技术中的问题之一是不存在用于有效地包囊溶质(例如，对于诱导CTL应答所必需的蛋白质)的方法。在产生病毒体所处的脂质浓度(大约ImM的脂质)下，并且假定其直径为大约200nm，少于1%的水相最终被包囊在病毒体内(Schoen等人，J. Liposome Res. , 3:767-792，1993)。这些特征显著地降低了病毒体将抗原或基因释放至细胞的效率。最近在专利申请号US20100015214中公开的用于克服该限制并产生关于CD8+T细胞的免疫原性制备物的策略基于空病毒体与载体(优选地，脂质体)(其包囊有所述抗原)的组合。US20100015214描述了关于病毒体的反式佐剂(trans-a djuvant)效应,尽管这些颗粒和所述脂质体并不展现出任何的彼此之间的物理相互作用。在发表于J Liposome Res.，2008，18 (I)，1-19中的Lanio等人的文章之中，对于rhEGF，描述了通过脱水-再水化的方法获得(DRV)并且由以I: I的摩尔比的饱和磷脂酰胆碱(PC) (二棕榈酰磷脂酰胆碱，DPPC)和胆固醇(Cho)构成的脂质体的较高的包囊-保留效率，相比于包含不饱和PC和Cho的那些而言。事实上，DRV的获得方法产生了具有多个双层的囊泡，其对于各种各样的可溶性溶质具有高的包囊/保留效率。Lanio等人证明了这些 囊泡的免疫佐剂特性，其用于增强针对rhEGF的在数量上和在质量上优异的抗体应答。在由人Ivarez等人所作并发表在Toxicon, 2009, 54(8) : 1135-47中的综述之中，概述了由加勒比海海葵(向日葵列指海葵)(Stichodactyla helianthus)这种海洋无脊椎动物产生并被作者命名为海葵溶细胞素(St)I和II (StI/II)的两种蛋白质的结构和功能特征。这些是属于海葵孔蛋白(Actinoporin)这一蛋白质家族(仅在海葵中发现的真核生物来源的独特的PFT类别)的成孔性毒素(PFT,pore-forming toxin)。与该家族的其他成员一样，St是具有高的等电点(>9. 5)的碱性蛋白质，其具有大约20kDa的分子量，在其氨基酸序列中缺乏半胱氨酸残基，并且偏好包含鞘磷脂(SM)的膜。St以可溶性形式产生，但可以容易地与不同的细胞膜和模型膜系统相联合从而形成直径为2nm的孔，这可能通过四个单体的N-末端的a螺旋的相互作用。这两个事件(联合和孔形成)均依赖于膜的物理-化学特性。在发表于Toxicon, 2007，49:68-81中的Martinez等人的文章之中，描述了 SM和Cho的存在对于通过StII的在膜中的“结合-孔形成”的重要性。膜的相态影响StII与这些结构的联合。根据由Martinez等人在Revista BiologIa, 2002, 16，2:85-93中所发表的文章，该毒素与DPPC和SM的膜可逆地联合，并且具有非常低的渗透能力。尽管已详尽地报告了细菌来源的成孔性毒素用于诱导特异于抗原的CTL应答的免疫调节特性，这通过使用各种不同的策略，包括将其在脂质体中进行运载，如在由Dietrich 等人和由 Mor6n 等人分别在 TRENDS in Microbiology, 2001, Vol. 9No. 1,23-28 和TRENDS in Immunology, 2004，Vol. 25No. 2，92-97中所作的综述之中所概述的那样；但根本没有提及在功能上同源的且源自海洋真核生物的毒素。从将其应用于肿瘤疾病的免疫治疗的观点看，所希望的是拥有新的疫苗组合物，其能够诱导特异于抗原的细胞免疫应答并且具有比包含细菌毒素的那些组合物更少的侵袭性。专利技术简述令人惊讶地，本专利技术的作者发现，当以包囊在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·E·费尔南德斯莫利纳，M·E·拉尼奥鲁伊斯，R·J·拉沃尔德金塔纳，Y·克鲁斯莱亚尔，M·D·C·卢萨多洛伦索，C·梅萨帕迪略，C·M·阿尔瓦雷斯巴尔卡塞尔，I·F·帕索斯桑托斯，M·特胡卡马丁内斯，A·巴列加拉伊，M·E·阿隆索比奥斯卡，L·卡内特桑托斯，
申请(专利权)人：分子免疫中心，
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