一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法技术

本发明专利技术公开了一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法。具体操作步骤如下：（1）将蛹虫草（Cordycepsmilitaris）的菌丝接到PDA固体培养基上活化，生成大量浓密菌丝的菌苔；（2）将菌苔接到种子培养基振荡培养，5天后形成大量菌球体，制得种子液；（3）将种子液转接到种子液发酵罐进行扩培；（4）将扩培种子液再转接到500L罐进行首批发酵；（5）相同条件下，500L罐10批次半连续发酵。本发酵工艺中采用调节培养基组成及发酵条件的方法，控制蛹虫草形成形状规则、大小均一的菌丝球，其直径平均在3~5mm，易于发酵液和菌体分离；利用蛹虫草菌丝球反复发酵，节约菌丝球生长所需的碳氮源及其他无机盐，节约了成本；缩短了发酵周期，提高了发酵强度，适于工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物与发酵工程
，具体地说是利用蛹虫草菌丝在培养体系中聚集、凝絮而形成的菌丝球，实施蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法。
技术介绍
蛹虫草(Cordyceps militaris)，虫草属的重要种，是一种昆虫强致病菌，含有虫草素、虫草多糖、虫草酸等多种活性成分。其中虫草素(cordycepin，3’-脱氧腺嘌呤核苷)，是一种核苷类抗生素．具有多种生物活性，被证明能提高人体免疫力，对于肿瘤和致病性的细菌和真菌表现出一定的抗性，成为近年来研究的热点，已经成功用于治疗在小鼠模型上人类非洲锥虫病(HAT)，被确认在白血病和癌症上有药物应用价值。国内外报道虫草素的获得途径主要有3个：①人工合成，该方法过程复杂，且产生许多对环境有害的物质，还没有见到大规模生产的报道；②固体发酵，从虫草属真菌的子实体或培养残基中提取。固体发酵培养周期长，培养条件苛刻，成本高且产量低；③液体发酵，从发酵液和菌丝体中提取。液体发酵周期短，培养基组成简单，为近年来研究的热点。已报道的液体发酵生产虫草素的方法主要为分批发酵工艺，虫草素主要存在于发酵液内，发酵周期在10-15天，发酵结束时大量健壮的蛹虫草细胞得不到充分利用，菌体利用时间短，发酵强度低。蛹虫草深层液体发酵生产虫草素过程中，菌体形态复杂，有丝状、片状、球状、块状等，对传质、溶氧等有着重要的影响。通过调节培养基组成及发酵条件控制蛹虫草菌体形态，反复利用活性蛹虫草细胞，实现蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素，缩短发酵周期，提高发酵强度，对大规模生产虫草素有重要意义。
技术实现思路
>为了使发酵结束时大量健壮的蛹虫草细胞得到充分利用，缩短发酵周期，提高发酵强度，本专利技术提供一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法。本专利技术所用蛹虫草购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，拉丁学名：Cordyceps militaris，保藏号：3.4655。一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的操作步骤如下：A、菌种活化：将蛹虫草（Cordyceps militaris）的菌丝接种到PDA固体培养基上，温度20～25℃条件下避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部由白转至橙黄，得到活化的菌苔；B、制备种子液：取面积6～10 mm2的菌苔1～2块接入种子培养基，摇瓶的装液量为130/250 mL，于温度20～25℃、摇床转速为120～150 r/min条件下，培养5～7d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；种子培养基的制备方法：土豆汁200 mL、酵母10 g、葡萄糖40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g和硫酸镁（MgSO4）1.0 g混匀，补水至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；土豆汁的做法：去皮马铃薯100 g，加500 mL自来水煮沸20min，用4～6层纱布过滤，滤液补足到500mL； C、种子液的扩培：将1L种子液转接至9L液体培养基中，温度20～25℃、通气流量1.5～2.0 L/(L·min)、搅拌速度100～120 r/min条件下，搅拌培养5～7 d，实现菌丝球的更新与扩增，制得蛹虫草种子液；所述液体培养基及制备方法同B步骤中的种子培养基及制备方法；D、500 L罐首批发酵将30L蛹虫草种子液转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、通气1.5～2.0 L/(L·min)、搅拌速度100～120 r/min条件下，培养10 d；发酵结束，截留住蛹虫草菌丝球，正压放料300 L，首批发酵得虫草素产量为63.91 mg/L；所述发酵培养基的制备方法：将酵母粉10-15 g、葡萄糖30-40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0-3.0 g、硫酸镁（MgSO4） 1.0-2.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0-2.0 g、硝酸钾（KNO3） 0.5-1.0 g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1-0.5 g 溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；E、500 L罐重复发酵重复D步骤进行10批次半连续发酵；即每次无菌正压放料排出发酵液300 L，再往罐内正压补充所述发酵培养基至原体积375 L，发酵控制条件不变；最后将11批次的发酵液合并，即得虫草素发酵液产品；重复批次发酵过程中的发酵培养基的制备方法：将酵母粉3-5 g，葡萄糖15-20 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0-3.0 g、硫酸镁（MgSO4） 1.0-2.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0-2.0 g、硝酸钾（KNO3）0.5-1.0 g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1-0.5 g溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；重复批次发酵过程中每批次发酵时间5 d，虫草素产量稳定在60 mg/L以上，发酵强度保持在15 mg/(L·d) 以上，细胞活力稳定在90%以上。本专利技术的蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法与常规蛹虫草液体培养方法相比，具有菌体可反复使用、发酵强度高，目标产量和转化率高，产物和细胞易于分离等特点，易于实现工艺过程的连续化、自动化，降低生产成本，有益技术效果具体体现在以下方面：（1）采用调节培养基组成及发酵条件的方法，控制蛹虫草形成均一菌丝球形态，不采用细胞生长和虫草素合成所需营养物质以外的其他任何化学物质，蛹虫草的生长和代谢不受干扰，有利于虫草素的合成；（2）利用蛹虫草菌丝球反复发酵，缩短了发酵周期，提高了发酵强度，节约了菌体生长消耗的碳氮源，节约了成本；（3）发酵过程中，蛹虫草形成形状规则、大小均一的菌丝球，其直径平均在3~5 mm范围内，易于发酵液和菌丝体分离；（4）半连续液体发酵生产虫草素，工艺操作简单，易于实现自动化生产。具体实施方式下面通过实施例，对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术所用蛹虫草的菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，拉丁学名：Cordyceps militaris，保藏号：3.4655。实施例11、菌种活化：用接种环取斜面上蛹虫草（Cordyceps militaris）的菌丝接种到PDA固体培养基上，25℃条件下避光培养5d，培养基表面上长满菌丝，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部由白转至橙黄，得到活化的菌苔；2、制备种子液：取面积6～10mm2的菌苔2块接入种子培养基（250 mL锥形瓶中装入100mL培养基）于25℃、摇床转速为150 r/min条件下，培养5 d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；种子培养基的制备方法：土豆汁200mL、酵母粉10g、葡萄糖40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g和硫酸镁（MgSO4）1.0 g溶于1000 mL自来水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；土豆汁的做法：去皮马铃薯100 g，加500 mL自来水煮沸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法，其特征在于：A、菌种活化：将蛹虫草（Cordyceps？militaris）的菌丝接种到PDA固体培养基上，温度20～25℃条件下避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部由白转至橙黄，得到活化的菌苔；B、制备种子液：取面积6～10？mm2的菌苔1～2块接入种子培养基，摇瓶的装液量为130/250？mL，于温度20～25℃、摇床转速为120～150？r/min条件下，培养5～7d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；种子培养基的制备方法：土豆汁200？mL、酵母10？g、葡萄糖40？g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0？g和硫酸镁（MgSO4）1.0？g混匀，补水至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；土豆汁的做法：去皮马铃薯100？g，加500？mL自来水煮沸20min，用4～6层纱布过滤，滤液补足到500mL；？C、种子液的扩培：将1L种子液转接至9L液体培养基中，温度20～25℃、通气流量1.5～2.0？L/(L·min)、搅拌速度100～120？r/min条件下，搅拌培养5～7？d，实现菌丝球的更新与扩增，制得蛹虫草种子液；所述液体培养基及制备方法同B步骤中的种子培养基及制备方法；D、500？L罐首批发酵将30L蛹虫草种子液转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、通气1.5～2.0？L/(L·min)、搅拌速度100～120？r/min条件下，培养10？d；发酵结束，截留住蛹虫草菌丝球，正压放料300？L，首批发酵得虫草素产量为63.91？mg/L；所述发酵培养基的制备方法：将酵母粉10？15？g、葡萄糖30？40？g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0？3.0？g、硫酸镁（MgSO4）？1.0？2.0？g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0？2.0？g、硝酸钾（KNO3）？0.5？1.0？g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1？0.5？g？溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；E、500？L罐重复发酵重复D步骤进行10批次半连续发酵；即每次无菌正压放料排出发酵液300？L，再往罐内正压补充所述发酵培养基至原体积375？L，发酵控制条件不变；最后将11批次的发酵液合并，即得虫草素发酵液产品；重复批次发酵过程中的发酵培养基的制备方法：将酵母粉3？5？g，葡萄糖15？20？g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0？3.0？g、硫酸镁（MgSO4）？1.0？2.0？g、磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0？2.0？g、硝酸钾（KNO3）0.5？1.0？g和硫酸亚铁（FeSO4）0.1？0.5？g溶于1000mL水中，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min；重复批次发酵过程中每批次发酵时间5？d，虫草素产量稳定在60？mg/L以上，发酵强度保持在15？mg/(L·d)？以上，细胞活力稳定在90%以上。...

【技术特征摘要】
1.一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法，其特征在于：
A、菌种活化：
将蛹虫草（Cordyceps militaris）的菌丝接种到PDA固体培养基上，温度20～25℃条件下避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部由白转至橙黄，得到活化的菌苔；
B、制备种子液：
取面积6～10 mm2的菌苔1～2块接入种子培养基，摇瓶的装液量为130/250 mL，于温度20～25℃、摇床转速为120～150 r/min条件下，培养5～7d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；
种子培养基的制备方法：土豆汁200 mL、酵母10 g、葡萄糖40 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0 g和硫酸镁（MgSO4）1.0 g混匀，补水至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；
土豆汁的做法：去皮马铃薯100 g，加500 mL自来水煮沸20min，用4～6层纱布过滤，滤液补足到500mL； 
C、种子液的扩培：
将1L种子液转接至9L液体培养基中，温度20～25℃、通气流量1.5～2.0 L/(L·min)、搅拌速度100～120 r/min条件下，搅拌培养5～7 d，实现菌丝球的更新与扩增，制得蛹虫草种子液；
所述液体培养基及制备方法同B步骤中的种子培养基及制备方法；
D、500 L罐首批发酵
将30L蛹虫草种子液转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏兆军，方婷婷，章建国，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：